中國南方漢族人群中SCN5A基因多態(tài)位點和病態(tài)竇房結(jié)綜合征的關聯(lián)性.pdf

1、心律失常是影響人們身體健康的一種重要病癥，是常見的致死原因之一。分子遺傳學的重要進展，在心律失常的發(fā)病機理的理解和治療方面為我們提供了很大的幫助。50%～75%的長QT綜合征（LQTS）和15%～35%Brugada綜合征（BS）的致病基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)（LQTS：鉀通道 KCNQ1，KCNH2LQTS2，KCNE1，KCNE2，KCNJ2；鈉通道基因SCN5A；非離子通道基因ankyrin-B。BS：SCN5A）。目前對LQTS致病基因的

2、研究最多也最成熟，根據(jù)致病基因的不同分成了LQTl-LQT6六個亞型。 心臟鈉離子通道基因SCN5A的突變也可導致心臟傳導疾病和常染色體隱形病態(tài)竇房結(jié)綜合征（SSS），散發(fā)型SSS也與心臟起搏鉀離子通道基因HCN4的突變有關。在一個先天性SSS病人中，發(fā)現(xiàn)位于染色體15q24-25的人類超極化激活環(huán)核苷調(diào)控的通道4（HCN4基因）的第一個堿基缺失的雜合突變HCN4-573X[25]。HCN4基因編碼一個具有6個跨膜片段的鉀通道，

3、負責形成心臟起搏電流If，是竇房結(jié)細胞中心舒張期除極化過程的決定因素。突變的HCN4-573X通道對胞內(nèi)升高的cAMP水平不敏感，并有顯性-否定效應。 心律失常的基因研究還只是初步階段，發(fā)展迅速，并逐步地顯示指導臨床診治的重要性。通過連鎖分析及候選基因法已初步定位和確認了一些遺傳性心律失常的基因，進一步對基因突變的分型和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測可用于心律失常的危險

4、分型并指導作用。 SCN5A為3號染色體上編碼的鈉離子通道蛋白的基因，SCN5A基因的突變可導致心鈉電流紊亂，引發(fā)多種嚴重性的心律失常包括長QT綜合征3型（long QT syndrome3，LQT3）Brugada綜合征、特發(fā)性室顫、心臟傳導系統(tǒng)疾病等。Wang等首先報道發(fā)現(xiàn)SCN5A基因突變是LQTS3發(fā)病的基因基礎；Chen等報道發(fā)現(xiàn)Brugada綜合征的發(fā)病與SCN5A基因多態(tài)位點H558R相關；有報道美國非洲人種SC

5、N5A的S1102Y多態(tài)位點少數(shù)等位基因頻率7%但能明顯增加室性心律失常8倍，最近有研究發(fā)現(xiàn)SCN5A功能缺失突變和心肌病及房顫相關。Gouas等研究發(fā)現(xiàn)SCN5A基因的多態(tài)位點H558R、D1819D與QTc間期的長短明顯相關。LQT3是一組伴有竇緩或竇停的綜合征。有研究表明引起的LQT3的SCN5A1795insD突變可使鈉通道的失活不完全，減慢心率，引起竇緩。我們知道病態(tài)竇房結(jié)綜合征（sick sinus syndrome，SSS

6、）代表多種由竇房結(jié)功能障礙而導致的疾病，臨床上伴有明顯暈厥，頭昏眼花，乏力等癥狀；在心電圖上主要表現(xiàn)為竇性心動過緩，竇性停博和竇房阻滯，與竇性心動過緩共存的房性心動過速也有出現(xiàn)；且已有研究報道心臟鈉通道基因SCN5A的雜合突變可導致常染色體隱性SSS。所有這些SCN5A突變可導致鈉通道功能喪失或鈉通道調(diào)控能力顯著削弱。因此，我們推測SSS除了外在的致病因素外，基因的異?？赡苁怪子诎l(fā)生SSS，不能排除SCN5A基因的多態(tài)位點H558R

7、 D1819D4299+53T>C等與竇房結(jié)功能相關性。本次實驗在于闡明中國南方漢族人群中SCN5A基因多態(tài)位點C5457T（D1819D）與SSS的相關性。 目的: 闡明中國南方漢族人群中SCN5A基因多態(tài)位點C5457T（D1819D）與SSS的相關性。 研究對象和方法: 1、選取2006年10月至2007年12月在我科住院的SSS患者和因SSS已經(jīng)安裝起搏器來門診行起搏程控的患者，籍貫為長江以南省市

8、的漢族人108（男55，女53）例，年齡（62±10）歲，并排除并發(fā)心肌病、先天性心臟病、瓣膜性心臟病、甲狀腺功能亢進或減低，高血壓、冠心病，等疾病，且均符合《實用內(nèi)科學》SSS診斷標準。對照組為南方健康漢族人123（男72，女51）例，年齡（61±9）歲。兩組年齡與性別構(gòu)成均無顯著差異。 2、確定研究的SCN5A基因的多態(tài)位點根據(jù)Iwasa等報道的SCN5A基因的多態(tài)位點同時結(jié)合Chen等對120份健康南方漢族人群檢測SCN5

9、A基因多態(tài)位點結(jié)果，選取D1819D。 3、外周血白細胞DNA的提取采用常規(guī)酚-氯仿法抽提外周血白細胞DNA。 4、PCR擴增根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲取SCN5A基因（Genebank NM000335，AP006241.1）的序列，利用Primer primer5軟件設計引物，擴增包含D1819D多態(tài)位點的相應片段。正向引物為ATTGCCATCATCCTGGAGA，反向引物為CTTTTGGTGAAGGCAAAGAGA，PC

10、R擴增產(chǎn)物長度為278 bp。 5、所有對象的基因鑒定采用限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP），以限制性內(nèi)切酶為HinlI進行單核苷酸多態(tài)性基因鑒定。 6、隨機抽取PCR產(chǎn)物進行純化和直接測序，純化和測序步驟由大連寶生物公司完成。所用測序儀為AB1377自動測序儀，驗證RFLP結(jié)果的準確性。 7、統(tǒng)計方法統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用X2檢驗，單變

11、量Logistic回歸分析D1819D基因多態(tài)性與SSS的關系，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 1、SCN5A基因的D1819D多態(tài)位點在中國華南地區(qū)漢族人群中分布的3種基因型20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果表明：D1819D多態(tài)位點的PCR擴增產(chǎn)物顯示為278 bp的DNA條帶。HinlI酶切后得到3種DNA條帶。野生純合子（CC）基因型可酶切成兩個片段：123 bp、155 bp；雜合子（CT）基因酶切

12、后為三個片段顯示為278 bp、155 bp、123 bp；突變的純合子（TT）基因型酶切后為一個片段，凝膠分析顯示為278 bp-個條帶。隨機抽取PCR產(chǎn)物進行純化和直接測序，驗證了RFLP結(jié)果的準確性。 2、SSS組108（男55，女53）例，年齡（61.83±10.49）歲。正常人組123（男72，女51）例，年齡（60.76±9.47）歲兩組年齡之間比較采t檢驗，t值為0.814p值為0.416。即兩組之間年齡無顯著差異

13、。兩組性別之間的比較采用x2檢驗，x2為1.346，p值為0.246。即兩組間性別無顯著差異。D1819D SNP等位基因頻率在人群中的分布符合Handy-Weinberg平衡，SSS組和正常對照組基因型頻率分布基于Handy-Weinberg公式計算結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（x2=4.103 and3.604，P=0.129and0.165）。 3、D1819D基因多態(tài)位點三種基因型在SSS組和正常人組中的分布意義正常對照組（12

14、3例），CC基因型在占39.0%（48），CT基因型36.6%（45）TT基因型24.3%（30），其中C等位基因57.3%（141），T等位基因42.7%（105）； SSS組（108例）的患者基因型分布特點：CC基因型22.2%（24例）、CT基因型44.4%（48例）、TT基因型33.3%（36例），其中C等位基因占44.4%（96）、T等位基因占55.6%（120）。SSS組與對照組三種基因型分布差異有顯著性意義（X2=7.70

15、1p=0.021），SSS組TT基因型、T等位基因比例明顯高于CC基因型，和C等位基因。SSS組和對照組基因型的比較，結(jié)果顯示病例組的CC基因型頻率顯著低于對照組，（X2=7.567p=0.006，OR=0.446，95%CI0.250-0.798）提示CC基因型可能是SSS發(fā)生的保護基因。 4、D1819D多態(tài)位點對SSS的相對危險度單變量logistic回歸分析D1819D多態(tài)位點與SSS的關系雖然TT基因型不能顯著增加SS