體外擴(kuò)增心臟側(cè)群細(xì)胞參與心肌重建的實驗研究.pdf

1、SP（sidepopulation）細(xì)胞是近年來人們關(guān)注的一群成體干細(xì)胞。1996年Goodell等[46]首先發(fā)現(xiàn)于骨髓，并稱之為SP細(xì)胞（中文稱之為邊緣群或側(cè)群細(xì)胞）。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞在成體組織中廣泛存在。來源于心臟的SP細(xì)胞（CSP）在體外與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)條件下能向心肌細(xì)胞分化。直接回輸體內(nèi)實驗也證實CSP細(xì)胞能夠形成心肌樣細(xì)胞，參與損傷心肌的修復(fù)。然而成體心臟組織中，CSP細(xì)胞含量較少，不能滿足臨床治療的需要。因此本課題進(jìn)一步

2、探討CSP細(xì)胞通過體外培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增的可能性及其擴(kuò)增細(xì)胞參與心肌重建的能力。 目的：1.觀察CSP細(xì)胞能否體外培養(yǎng)擴(kuò)增。2.擴(kuò)增的CSP是否具有干細(xì)胞特性。3.探討移植體外擴(kuò)增CSP細(xì)胞在梗死心肌重建中的作用。 方法：1.采用多次胰酶消化法從SD新生大鼠心臟制備心肌細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞分選分離獲取CSP細(xì)胞。用DMEM+10%FBS培養(yǎng)CSP細(xì)胞；通過RT—PCR檢測Bcrpl、c—kit、MDR1、GArA4、β—MH

3、C等標(biāo)志，對擴(kuò)增的CSP細(xì)胞進(jìn)行鑒定；2.采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立鼠AMI動物模型，并隨機(jī)分為兩組：細(xì)胞移植組即刻移植Dil標(biāo)記的CSP細(xì)胞：對照組不移植CSP細(xì)胞。3.分別于建模成功后第3、7、14、28天，進(jìn)行心臟超聲檢查及組織取材，組織冰凍切片通過HE染色和免疫熒光染色，觀察移植的CSP細(xì)胞參與梗死心肌重建的情況。 結(jié)果： 1.每10只新生鼠的心臟組織，經(jīng)分選可獲得3—24×104個CSP細(xì)胞。 2.

4、CSP細(xì)胞體外培養(yǎng)，呈小三角形、多角形、圓形、半圓形或不規(guī)則形等貼壁生長，增殖活躍；CSP細(xì)胞反復(fù)傳代培養(yǎng)后，仍具有很強(qiáng)的增殖能力。 3.RT—PCR檢測結(jié)果顯示：原代CSP細(xì)胞表達(dá)Bcrp1和MDR1，低表達(dá)c—Kit，不表達(dá)GATA4和β—MHC。體外擴(kuò)增的CSP細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長和傳代次數(shù)的增加，逐漸表達(dá)心肌標(biāo)志心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA4和成熟標(biāo)志β—MHC，但同時持續(xù)高表達(dá)c—Kit和MDR1，而Bcrp1在逐漸減弱

5、或消失。 4.心臟超聲檢測：細(xì)胞移植組第28天的LVEF值（LVEF：71.1833±13.17553%）與對照組第28天的LVEF值（LVEF：46.2600±14.53801%）相比，統(tǒng)計學(xué)分析顯示兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 5.組織學(xué)觀察：冰凍切片HE染色光鏡觀察顯示：各標(biāo)本均出現(xiàn)左室前壁心肌壞死區(qū)，心梗區(qū)室壁變薄.證實心梗建模成功。免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在CSP細(xì)胞移植后第7、14、28天，在各

6、心梗區(qū)內(nèi)及周圍均發(fā)現(xiàn)有Dil標(biāo)記的CSP細(xì)胞嵌入并表達(dá)心肌早期標(biāo)志GATA4和成熟標(biāo)志MHC。 結(jié)論： 1.CSP細(xì)胞能夠在體外擴(kuò)增培養(yǎng)并反復(fù)傳代，且傳代CSP細(xì)胞仍具有很強(qiáng)的增殖能力。 2.擴(kuò)增的CSP細(xì)胞隨著傳代培養(yǎng)的時間延長，逐漸向心肌細(xì)胞分化，但仍具有心肌干細(xì)胞特性。 3.擴(kuò)增的CSP細(xì)胞在體內(nèi)能夠向心肌細(xì)胞分化，參與梗死心肌的再生修復(fù)。 4.擴(kuò)增的CSP細(xì)胞心粳移植后能有效提高左室射血分