人牙髓干細胞體外三維培養(yǎng)擴增的實驗研究.pdf

1、背景及目的: 干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的未分化細胞，根據(jù)其來源可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞(embryonicstemcellsESC)的研究由于受到倫理道德、種族觀念的約束和潛在異體排斥反應(yīng)的影響，其應(yīng)用前景不是十分樂觀。成體干細胞(adultstemcellsASC)因具有來源廣泛、可塑性強、無排斥反應(yīng)等優(yōu)勢已成為近年來研究的熱點之一。目前已經(jīng)在機體幾乎所有組織中發(fā)現(xiàn)了成體干細胞，其中包括骨髓、軟骨

2、、血液、血管、神經(jīng)、肌肉、脂肪、皮膚、角膜、腸、肝臟以及胰腺等。 牙髓干細胞(dentalpulpstemcellsDPSCs)作為成體干細胞中較年輕的一員，于2000年首次由Gronthos等提出。他們把通過酶分離具有克隆形成能力的、高增殖率的人牙髓細胞命名為DPSCs。以后許多學(xué)者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)人脫落的乳牙、豬、小鼠、大鼠等的牙髓中也有DPSCs的存在，并對其特性、定位、體外擴增進行了研究。DPSCs的發(fā)現(xiàn)，為牙髓損傷及修復(fù)機制的

3、研究提供了一個新的平臺，更為重要的是，為牙齒組織工程學(xué)帶來了突破性進展。 許多學(xué)者對DPSCs的特性、定位及擴增進行了研究，但常規(guī)二維(2-dimention2D)培養(yǎng)費時、緩慢、占用空間較大、容易污染，已經(jīng)影響了牙齒組織工程種子細胞的大規(guī)模擴增。近年發(fā)展起來的旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotarycellculturesystemRCCS)和微載體(microcarrier)相結(jié)合的三維(3-dimention3D)培養(yǎng)方法，已廣泛地

4、應(yīng)用于貼壁細胞的培養(yǎng)和擴增，為組織工程種子細胞的大規(guī)模擴增提供了可能。 微重力組織工程(microgravitytissueengineering)是近年來由美國空間生物技術(shù)研究人員開創(chuàng)的一個獨特研究領(lǐng)域，其核心技術(shù)是利用轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器(rotatingwallvesselbioreactorRWVB)形成的模擬微重力(simulatedmicrogravity)環(huán)境，進行動物細胞的三維培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)又稱轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)

5、器，利用RCCS進行動物細胞三維培養(yǎng)時，由于旋轉(zhuǎn)過程中正常的重力向量持續(xù)隨即化，使細胞處于一種模擬自由落體狀態(tài)，在一定程度上類似于微重力環(huán)境，因此稱之為模擬微重力。 本研究在對人DPSCs進行分離、培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，利用微載體在RCCS中進行三維培養(yǎng)，對其在體外的大規(guī)模擴增的可行性進行初步探討。 方法: 1.在我科以往研究的基礎(chǔ)上，參考并改進Gronthos等的方法，從成人健康的第二前磨牙中獲取牙髓，用酶消化法

6、和酶解組織塊法進行原代DPSCs培養(yǎng)并常規(guī)傳代。人DPSCs的鑒定從以下三方面進行：(1)細胞克隆形成率(colonyformingunit-fibroblastCFU-F)；(2)細胞免疫表型：免疫組化和RT-PCR檢測細胞vimentin(間充質(zhì)細胞標(biāo)志)、CD44(未分化間充質(zhì)細胞標(biāo)志)、nestin(神經(jīng)嵴來源細胞標(biāo)志)、desmin(肌細胞標(biāo)志)、DSP(成牙本質(zhì)細胞標(biāo)志)、osteocalcin(鈣化組織標(biāo)志)的表達；(3)

7、細胞的多向分化潛能：肌細胞誘導(dǎo)和成牙本質(zhì)細胞誘導(dǎo)。 2.人DPSCs的三維培養(yǎng)：將處理好的0.25gCytodex3微載體與50ml含1×105/mi第4代DPSCs的新鮮DMEM/F12(含15％FBS)混合均勻，裝入經(jīng)高壓滅菌的HARV中，此時，培養(yǎng)基充滿整個容器，無氣泡，調(diào)整轉(zhuǎn)速，使微載體不與器壁碰撞，不在中心聚集。整個裝置放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中。常規(guī)換液。三維培養(yǎng)后，免疫組化檢測vimentin、CD44、GF

8、AP、desmin和DSP的表達。 描繪細胞生長曲線：(1)二維培養(yǎng)：第4代DPSCs以1×105/mi的密度接種于24孔板中，每孔1ml，常規(guī)換液。培養(yǎng)基為DMEM/F12(含15％FBS)。每天將3孔細胞消化，臺盼藍染色，用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)，取其平均數(shù)；(2)三維培養(yǎng)：每天在旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下取樣0.3ml。其中0.1ml用于細胞計數(shù)，樣品沉淀，棄上清，沉淀中加入等量0.1％結(jié)晶紫(0.1mol/L檸檬酸)溶液，置37℃，3

9、0min后反復(fù)吹打，計數(shù)細胞核，即為活細胞數(shù)。其余用于倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果: 1.酶消化法原代培養(yǎng)的DPSCs，貼壁慢，生長慢，48h后呈克隆樣生長，多數(shù)細胞為長梭形的成纖維細胞樣細胞，少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形，90％匯合時常規(guī)傳代。酶解組織塊法原代培養(yǎng)的牙髓細胞為長梭形的成纖維細胞樣細胞，呈放射狀排列。2.酶消化法和酶解組織塊法培養(yǎng)的DPSCs的CFU-F分別為41克隆/104細胞和8克隆/104細胞。細

10、胞免疫表型檢測結(jié)果：vimentin、CD44、GFAP、nestin、osteocalcin陽性，desmin、DSP陰性。 3.DPSCs經(jīng)成肌分化誘導(dǎo)，部分細胞胞體明顯增大，約23d左右，有粗桿狀的肌管樣細胞形成，免疫組化檢測有desmin的表達。 礦化液連續(xù)培養(yǎng)26d，DPSCs呈復(fù)層生長，形成細胞結(jié)節(jié)，并鈣化，茜素紅染色陽性，抗DSP陽性。 4.在三維空間培養(yǎng)，接種24h后，細胞大部分貼附于微載體表面，

11、呈半球形，至第9d，長滿微載體表面。三維培養(yǎng)后免疫組化檢測vimentin、CD44、GFAP、desmin和DSP的表達，和培養(yǎng)前一致。 在二維及三維空間培養(yǎng)描繪的細胞生長曲線圖，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，兩者之間存在顯著差異(P＜0.05)。 結(jié)論: 1.從成人健康的第二前磨牙牙髓分離到了具有克隆形成能力的DPSCs，經(jīng)定向誘導(dǎo)，可分化為肌細胞和成牙本質(zhì)細胞，具有干細胞的特性。 2.采用Cytodex3微載