體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的 心肌細(xì)胞丟失、瘢痕形成及心室重構(gòu)是造成心臟功能惡化的主要因素，也是最終導(dǎo)致慢性充血性心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)。細(xì)胞移植治療是治療心臟疾病的一種新策略。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)目前被認(rèn)為是細(xì)胞移植治療最理想的種子細(xì)胞。研究BMSCs體外定向分化為心肌樣細(xì)胞對細(xì)胞移植治療心臟疾病具有重要的理論和臨床意義，本課題旨在通過生物誘導(dǎo)及5-氮胞苷(5-aza)化學(xué)誘導(dǎo)等方法體外誘導(dǎo)BMSCs定向分化，檢測BMSCs是否可分化為心肌樣細(xì)胞

2、，觀察5-aza對BMSCs生長增殖的影響，并在體外建立各種模擬心肌內(nèi)微環(huán)境模型，對BMSCs分化的各種可能機制作一探討。 方法 體外分離、培養(yǎng)BMSCs和胚胎心肌細(xì)胞，取第4代BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)實驗，分為生物誘導(dǎo)組和化學(xué)誘導(dǎo)組。生物誘導(dǎo)組分別采用胚胎心肌細(xì)胞與BMSCs直接混合培養(yǎng)、胚胎心肌細(xì)胞與BMSCs 間接混合培養(yǎng)及胚胎心肌細(xì)胞勻漿液誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs，6天后進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色檢測，觀察BMSCs是否分化為

3、心肌樣細(xì)胞?；瘜W(xué)誘導(dǎo)組采用5-aza進(jìn)行誘導(dǎo)處理，分別取濃度為5、10、15μmol/L的5-aza對BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)處理，處理時間又分別分為12小時、24小時、48小時三個時間段，然后繼續(xù)用BMSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)28天后免疫細(xì)胞熒光染色鑒定。同時，本實驗還觀察了5-aza對第4代BMSCs生長增殖的影響，取生長良好的第4代BMSCs經(jīng)5-aza處理24小時后繼續(xù)培養(yǎng)，然后間隔24小時作一次細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，并與對照組進(jìn)行比較

4、分析。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計采用SPSSl2.0 for windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示，組間比較用t檢驗，p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1．BMSCs呈梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，貼壁集落樣生長，但傳至10代以后，細(xì)胞逐漸失去增殖能力，生長逐漸停止。2．體外能成功分離、培養(yǎng)胚胎心肌細(xì)胞，免疫細(xì)胞熒光染色鑒定心肌細(xì)胞肌節(jié)肌動蛋白陽性，并可見到胞漿中的肌纖維結(jié)構(gòu)，但并未見心肌細(xì)胞搏動。

5、3．BMSCs只有在其與胚胎心肌細(xì)胞直接混合培養(yǎng)時，才能分化為心肌樣細(xì)胞，而在其它的生物誘導(dǎo)模式下卻未見其分化為心肌樣細(xì)胞。4．經(jīng)5-aza誘導(dǎo)處理后，未見BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞。5．5-aza能抑制BMSCs的生長增殖，尤其在細(xì)胞的對數(shù)生長期最為明顯。 結(jié)論 BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)處理后能夠在體外分化為心肌樣細(xì)胞，尤其是模擬心肌內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)是一種可行的生物誘導(dǎo)方法。在心肌微環(huán)境眾多因素中，機械因素是促進(jìn)BMSCs定向分化為心肌