體外模擬心肌微環(huán)境下胚胎干細胞向心肌樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：探討完整成熟心肌細胞或心肌細胞裂解物對胚胎干細胞(embryonic stem eells,ESCs)定向分化為心肌細胞的誘導(dǎo)作用及強度。 方法：收集昆明小鼠3.5d和4d胚齡的囊胚，分別將其培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上，4～5d后取隆起生長的內(nèi)細胞團分離后再培養(yǎng)，觀察集落的生長情況并通過堿性磷酸酶染色、OCT-4染色等對細胞集落進行鑒定。然后取3～4代ESCs,先將ESCs懸浮培養(yǎng)2～3d形成擬胚體(embryoid

2、 bodies，EBs)，再用大鼠心肌細胞等誘導(dǎo)因素對其誘導(dǎo)培養(yǎng)。共分5組進行定向誘導(dǎo)實驗，即心肌細胞誘導(dǎo)組、心肌細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)組、心肌細胞裂解液誘導(dǎo)組、胚胎干細胞分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)組和對照組。ESCs分化為心肌細胞的結(jié)果判斷，用相差顯微鏡觀察EBs搏動情況，用免疫細胞熒光技術(shù)檢測心肌細胞特異性肌鈣蛋白T(TnT)、a-肌動蛋白(a-Actin)的表達。 結(jié)果： ①采用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA室溫作用2-4分

3、鐘并輔以機械作用，分離克隆ESCs效果較好。 ②心肌細胞誘導(dǎo)組：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)第3天起有EBs自發(fā)性、有節(jié)律跳動，12d時有93％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的ESCs特異性肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達率56.5±13.44％，顯著高于其它各組(P＜0.05)。 ③心肌細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)組：12d時有8％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的：ESCs肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達率5.2±2.01％，顯著低于心肌細

4、胞誘導(dǎo)組(P＜0.05)，與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。 ④心肌細胞裂解液誘導(dǎo)組：12d時有36％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的ESCs特異性肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達率8.24±2.45％，顯著低于心肌細胞誘導(dǎo)組(P＜0.05)，顯著高于對照組(P＜0.05)。 ⑤胚胎干細胞分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)組：12d時有7％的EBs出現(xiàn)節(jié)律性收縮。已分化的ESCs特異性肌鈣蛋白T、a-Actin陽性表達率5.08±