調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及體外擴增的γδT細(xì)胞趨化機理的初步研究.pdf

1、第一部分小鼠調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的初步研究
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells, Tregs)是T細(xì)胞的一個亞群，能通過影響其它免疫細(xì)胞的活性來發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的功能。近年來，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成為免疫學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點:經(jīng)典的CD4+CD25+ TCRaβTreg的功能己經(jīng)基本明了，CD4+CD25" T細(xì)胞在體外經(jīng)過anti-TCR/CD3e的刺激和TGF-β的誘導(dǎo)可以轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+Treg,并且高表

2、達Treg的特異性標(biāo)記物Foxp3。γδT細(xì)胞雖然只占總T細(xì)胞的一小部分，但其獨特的抗原識別模式使得γδT細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。近年來，許多研究結(jié)果表明γδT細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能。我們感興趣的是小鼠的γδT細(xì)胞是否也具有免疫調(diào)節(jié)表型的亞群，以及是否可以在體外經(jīng)過anti-TCR的刺激和TGF-β的誘導(dǎo)而產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的γδT細(xì)胞。我們以小鼠脾臟的T細(xì)胞為研究體系，利用流式染色和RT-PCR方法檢測γδT細(xì)胞Foxp3的

3、表達情況。結(jié)果顯示，新鮮分離的小鼠脾臟γδT細(xì)胞并不表達Foxp3。然而，當(dāng)脾臟T細(xì)胞在固相化anti-TCRyβ抗體刺激下培養(yǎng)，并添加TGF-β(濃度為5ng/ml)誘導(dǎo)5-8天后，Realtime PCR和免疫熒光染色結(jié)果顯示，TGF-β誘導(dǎo)組的γδT細(xì)胞出現(xiàn)Foxp3的表達，與CD25表達相一致，而未誘導(dǎo)組的γδT細(xì)胞基本無Foxp3的表達。此外，相對于誘導(dǎo)組的TCRγδ+CD25" T細(xì)胞，誘導(dǎo)組的TCRγδ+CD25+T細(xì)胞不

4、僅表達Foxp3，還高表達免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子TGF-β和GITR。隨后，我們通過體外功能實驗證明誘導(dǎo)組的γδT細(xì)胞能夠明顯抑制anti-CD3抗體對初始T細(xì)胞的活化和增殖作用。綜上所述，小鼠γδT細(xì)胞在經(jīng)過固相化anti-TCRyβ刺激和TGF-β誘導(dǎo)后可以產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)表型和功能的細(xì)胞。
　　 第二部分腫瘤過繼免疫治療中γδT細(xì)胞趨化機理的初步研究
　　γδT細(xì)胞是一類不同于αβT細(xì)胞的特殊細(xì)胞。近年的研究表明,無論是

5、體內(nèi)還是體外,活化的γδT細(xì)胞都具有很強的殺傷各種實體腫瘤和血液腫瘤的活性。因此γδT細(xì)胞被認(rèn)為是用于腫瘤過繼免疫治療很有前景的細(xì)胞。然而γδT細(xì)胞在體內(nèi)是否能夠有效分布于腫瘤組織是其發(fā)揮抗腫瘤作用的前提。本實驗室建立了一套固相化anti-TCRγδ抗體體外擴增培養(yǎng)γδT細(xì)胞的方法,所獲γδT細(xì)胞制劑在體外具有很強的殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。為了考察γδT細(xì)胞制劑在體內(nèi),特別是腫瘤組織的分布規(guī)律,我們首先分析了培養(yǎng)后γδT細(xì)胞表面趨化因子受體

6、的表達情況,隨后以結(jié)直腸癌為研究對象,分析了結(jié)直腸癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中趨化因子的表達情況,最后利用趨化實驗和趨化封閉實驗考察了結(jié)直腸癌組織對γδT細(xì)胞的趨化作用。γδT細(xì)胞制劑制備于固相化抗體體外擴增的人外周血單個核細(xì)胞,γδT細(xì)胞在擴增前后趨化因子受體的表達情況采用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)進行分析。結(jié)果顯示CCR5和CXCR3是體外擴增的Vδ1T細(xì)胞和Vδ2T細(xì)胞表面主要的趨化因子受體。用RT-PCR法檢測4種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系

7、和10例人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本(每例均包括腫瘤組織和瘤旁組織)趨化因子的表達情況。結(jié)果表明,不同的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系能夠表達不同的趨化因子；人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中腫瘤組織和瘤旁組織也存在多種趨化因子的表達,其中均包括CCR5和CXCR3的配體分子。因此,我們以兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29和HR8348)為代表,進行了腫瘤細(xì)胞對γδT細(xì)胞的趨化實驗,并利用CCR5和CXCR3封閉抗體考察了兩種趨化因子受體在γδT細(xì)胞趨化作用中的貢獻。結(jié)果顯示經(jīng)過