應(yīng)用RT-LAMP技術(shù)檢測腸道病毒Coxsackievirus A6的研究.pdf

1、目的:柯薩奇病毒A組6型病毒(coxsackievirus A6,CVA6)是引起手足口病的常見病原體,且其引起的手足口病常伴有甲病變等癥狀。本實驗的目的在于建立一種適于廣泛推廣的檢測CVA6的快速高效、靈敏特異的僅需在單個試管中一步完成的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),以滿足快速識別CVA6感染的需要。

2、
　　方法:采集手足口病病人的糞便樣本進(jìn)行核酸擴(kuò)增并鑒定分型后,選取合適標(biāo)本用做反應(yīng)模板。在GenBank上下載編碼CVA6衣殼蛋白VP1的基因序列,利用在線軟件設(shè)計針對CVA6基因組VP1片段保守區(qū)的引物,在特異性引物和具有鏈置換活性的Bst聚合酶作用下進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng),探索CVA6-RT-LAMP方法的最佳反應(yīng)條件,肉眼觀察擴(kuò)增結(jié)果或取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,驗證其特異性并與常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse

3、transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)比較靈敏度。利用熒光PCR儀得到擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。
　　結(jié)果:優(yōu)化后的CVA6-RT-LAMP體系特異性強(qiáng),僅能擴(kuò)增出CVA6核酸,與其他型別的腸道病毒不發(fā)生非特異性擴(kuò)增反應(yīng);靈敏度高,約為CVA6-RT-PCR法的100倍;反應(yīng)快速,可在40分鐘內(nèi)達(dá)到反應(yīng)平臺期;熒光熔解曲線呈單峰狀,也說明反應(yīng)產(chǎn)物單一,特異性強(qiáng)。
　　結(jié)論:本