腸道病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立及應用.pdf

1、腸道病毒(Enteroviruses)隸屬于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),是最常見的可引起全球范圍內(nèi)疾病流行的病毒之一,其中人類腸道病毒包括柯薩奇病毒、?？刹《尽⒓顾杌屹|(zhì)炎病毒及一些新型腸道病毒。腸道病毒感染主要通過糞-口和口-口傳播。其中,接觸感染者糞便污染的水、食物及土壤可以導致糞-口傳播。每年全球感染腸道病毒人數(shù)可達數(shù)百萬,可導致一系列臨床疾病。腸道病毒的傳統(tǒng)檢測方法為病毒分離培養(yǎng),然后進行血清中和試驗定型分類

2、,培養(yǎng)結(jié)果通常需要1周左右,操作耗時、費用高。因此,建立一種高效、靈敏、快速、簡便的腸道病毒檢測技術對患者的及時診治具有重要的指導意義。
　　 Notomi T等(2000年)發(fā)明了環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),該技術具有更高的靈敏度及特異性,縮短了擴增時間,提高了擴增效率,并降低了儀器設備及檢測條件的要求。
　　 基于此,本研究利用LAMP技

3、術建立了靈敏度高、特異性強的腸道病毒檢測新方法,并成功應用于手足口病患兒糞便、飲用水源水及食品包裝樣品中腸道病毒的檢測及飲用水源水樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測。
　　 目的:
　　 建立腸道病毒通用LAMP檢測體系及脊髓灰質(zhì)炎病毒LAMP檢測體系,并分別應用于實際樣品中腸道病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒的定性檢測。應用實時RT-LAMP技術對天津市飲用水源水樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒進行定量檢測。
　　 方法:
　　 1

4、、從GenBank中收集腸道病毒基因序列,生物信息學分析得出特異性靶序列,設計出4條特異性引物。恒溫條件下經(jīng)鏈置換DNA聚合酶擴增。通過調(diào)整Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、反應溫度等優(yōu)化反應體系。評價此體系的特異性及靈敏度。將已建立的腸道病毒通用LAMP方法應用于手足口病患兒糞便、飲用水源水及食品包裝樣品中腸道病毒的檢測。LAMP擴增結(jié)果可通過肉眼觀察白色沉淀或在產(chǎn)物中加入SYBR Green I判定,也可通過內(nèi)切酶NlaIV

5、酶切及測序確定。
　　 2、從GenBank中收集脊髓灰質(zhì)炎病毒基因序列,分析其生物學信息,設計脊髓灰質(zhì)炎病毒LAMP引物。優(yōu)化LAMP反應體系,評價該體系的特異性及靈敏度。將已建立的脊髓灰質(zhì)炎病毒LAMP方法應用于9例天津市飲用水源水樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測。肉眼觀察白色沉淀或在產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ判斷檢測結(jié)果。LAMP產(chǎn)物也可通過內(nèi)切酶HpyCH4Ⅲ酶切鑒定。同時,隨機選取2例樣品擴增產(chǎn)物進行序列分析。

6、　　 3、應用實時RT-LAMP技術對18例天津市飲用水源水樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒進行定量檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1、本研究建立的腸道病毒通用LAMP檢測方法1-1.5小時即可完成檢測。該方法具有良好的特異性,可檢測包括腸道病毒71型、柯薩奇A16、B3、B5以及?？?0在內(nèi)的腸道病毒。其檢測下限為101copies/μL,與PCR檢測下限一致。樣品檢測結(jié)果表明,此方法對于水源水及糞便樣品的檢出率較高,分別為9/9

7、(100％)、18/19(94.7％),而4份食品包裝樣品全部為陰性。產(chǎn)物經(jīng)NlaⅣ酶消化后,主要產(chǎn)生103bp、87bp兩種片段,與預期結(jié)果一致。隨機選取的10例樣品產(chǎn)物測序表明,2例樣品與柯薩奇A16高度同源,8例樣品與腸道病毒71型高度同源。
　　 2、本研究建立的脊髓灰質(zhì)炎病毒LAMP檢測方法1-1.5小時即可完成檢測。該方法具有良好的特異性,除脊髓灰質(zhì)炎病毒外,對其它類型腸道病毒及甲肝病毒均無擴增。其檢測下限為101c

8、opies/μL,與傳統(tǒng)PCR基本一致,但所需設備簡單、快速,且結(jié)果觀測方便。9例飲用水源水樣品檢測結(jié)果表明,8例樣品中檢測出脊髓灰質(zhì)炎病毒。產(chǎn)物經(jīng)HpyCH4Ⅲ酶消化,主要產(chǎn)生大小為97bp的片段,與預期結(jié)果一致。2例樣品產(chǎn)物經(jīng)測序表明均與脊髓灰質(zhì)炎病毒高度同源。
　　 3、超濾離心管濃縮方法中病毒的回收率為34.83％。實時RT-LAMP方法對18例水樣中的脊髓灰質(zhì)炎病毒定量檢測表明,陽性結(jié)果中脊髓灰質(zhì)炎病毒的濃度范圍為7.