環(huán)境水體中腸道病毒(Enterovirus)的濃縮與檢測.pdf

1、腸道病毒(Enterovirus,EV)是影響人體健康的重要病原微生物之一。本研究建立環(huán)境水體中EV的濃縮和實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法,并應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境水體中EV的濃縮和檢測。
　　以陶瓷納濾膜(NanoCeram)為基礎(chǔ),自主設(shè)計(jì)環(huán)境水體病毒采集濃縮儀,由蘇州納濾有限公司完成組裝。實(shí)驗(yàn)室模擬水樣測試病毒濃縮儀及其預(yù)處理膜、洗脫液以及蠕動泵等參數(shù)對 EV病毒濃縮和回收率的影響。結(jié)果顯示:模擬水樣和洋橋河流水樣濃縮后,濃縮液均檢出EV;

2、無預(yù)處理膜時(shí),EV回收率為37.0％;同時(shí)使用納濾膜和粗濾膜時(shí)回收率為12.3%;同時(shí)使用納濾膜和微孔濾膜時(shí)病毒回收率為6.6%,三級濾膜同時(shí)使用時(shí)回收率只有5.4%;使用蠕動泵洗脫納濾膜使病毒回收率從原來的37.0%提高到72.4%;1×PBS、0.15M Na3PO4和0.15M Na2HPO4三種洗脫液對病毒的回收率分別為46.9%、51.2%、51.7%。
　　從已知的陽性 EV標(biāo)本中擴(kuò)增目的片段、克隆質(zhì)粒以及鑒定;紫外分

3、光光度測定濃度,十倍梯度稀釋法配制實(shí)時(shí)定量PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。建立EV實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法,并考察其特異性、靈敏度和重復(fù)性。結(jié)果表明,實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法能特異性擴(kuò)增EV,不能擴(kuò)增諾如病毒GI、GII型,輪狀病毒,星狀病毒和腺病毒;該方法在10 copies/μl全部出現(xiàn)典型擴(kuò)增,而對標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5 copies/μl和1 copies/μl沒有全部出現(xiàn)典型擴(kuò)增,表明實(shí)時(shí)定量PCR的靈敏度為10 copies/μl;經(jīng)三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考

4、察,CV值均小于5%。
　　對北京市黃村、高碑店和小紅門三大污水處理廠出水口進(jìn)行 EV濃縮和實(shí)時(shí)定量PCR檢測。北京市三大污水處理廠出口水EV檢測均為陽性,其中小紅門最高分別是:(6.92±0.3)×105 copies/L、(8.13±0.4)×105 copies/L、(5.39±0.7)×105 copies/L,黃村污水處理廠次之:(6.52±1.3)×104 copies/L、(1.19±0.2)×105 copies/