犢牛腹瀉輪狀病毒分離鑒定及RT-LAMP檢測方法的建立.pdf

1、輪狀病毒(BovineRotavims,BRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavims),是引起各種幼齡動物病毒性腹瀉的主要病原之一。該病自報道以來,已在全世界主要養(yǎng)牛國家普遍發(fā)生和流行,給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。常用檢測方法有RT-PCR,EIASA等,可由于需要昂貴的設備和專業(yè)人員而不便于在臨床普遍應用,所以急需一種方便簡單的檢測方法。環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal

2、amplification,LAMP)通過具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶完成靶序列的擴增,僅需恒溫就能擴增核酸,并可通過核酸染料染色或者離心沉淀觀察結果,較之普通的RT-PCR方法,具有簡便、快速的特點。
　　 對保定地區(qū)發(fā)病牛場的犢牛腹瀉病料進行處理,得到疑似病毒液,然后將其接種到Marc-145細胞上,37℃CO2條件下盲傳四代后,細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、界限不清晰、崩解等病變。根據(jù)GenBank發(fā)表的牛輪狀病毒VP7基因序

3、列,設計了一對特異性引物。用此引物對出現(xiàn)細胞病變的培養(yǎng)液進行RT-PCR檢測,所得目的片段與預期片段長度(342bp)一致。將RT-PCR產(chǎn)物純化回收,進行克隆轉化及序列測定,分析結果與預期的結果相同。對該毒株的理化特性鑒定結果表明:該株牛輪狀病毒不耐熱,對氯仿、強酸、乙醚有良好的抵抗力。證實本研究分離出的病毒為牛輪狀病毒,命名為BD株。
　　 本研究將建立檢測BRV的RT-IAMP檢測方法。根據(jù)GenBank中發(fā)表的BRV基因

4、序列,用DNAstar進行分析和比對后發(fā)現(xiàn),VP7的基因序列相對保守,故針對VP7進行引物設計。利用PrimerExplorer4.0引物設計軟件,嚴格按照引物設計原則及注意事項進行引物設計,并對設計出的引物進行篩選,最終確定一組,包括外引物F3、B3,內引物FIP、BIY。用此引物對提取好的病毒RNA進行RT-LAMP反應,并對試驗反應條件進行優(yōu)化。結果表明,RT-LAMP最佳反應溫度是62℃,反應時間為50min;優(yōu)化的各組分濃度分

5、別為:Mg2+2.5μL,dNTPs3.5μL,BstDNA聚合酶1.5μL。;外引物和內引物最佳濃度比為1:6,即外引物(F3:B3=1:1)共計為1μL,內引物(FIP:BIP=1:1)共計為6μL。對經(jīng)過摸索條件后建立的反應體系進行靈敏度、特異性、重復性和穩(wěn)定性試驗,結果表明,RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍;特異性試驗結果顯示無交叉反應存在,說明該檢測技術特異性較好;批間和批內的檢測結果無明顯差異,說明該檢測方法相