腸道病毒柯薩奇B5型巢式RT-PCR檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　 病毒性腦炎（ViralEncephalitis）是兒童時(shí)期常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、抽搐、意識(shí)障礙和腦膜刺激征等，易造成不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，嚴(yán)重威脅兒童身心健康。近年來(lái)，河南省發(fā)生了多起病毒性腦炎的暴發(fā)，經(jīng)檢測(cè)主要是由柯薩奇病毒B5(coxsachievirusB5，CVB5)引起。柯薩奇病毒B5是一種常見(jiàn)的能引起病毒性腦炎的腸道病毒，屬于腸道病毒屬小核糖核酸病毒，無(wú)包膜，單股正

2、鏈RNA，資料顯示其引起的病毒性腦炎在我國(guó)廣泛存在。
　　 病原的分離培養(yǎng)與PCR擴(kuò)增測(cè)序是鑒定CVB5的主要方法和金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其缺乏敏感性、檢出率低、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且費(fèi)用高，臨床上極少采用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)做為一種新的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度和特異度高、易標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，已被越來(lái)越多地應(yīng)用到腸道病毒診斷上來(lái)。但文獻(xiàn)中鮮見(jiàn)檢測(cè)腸道病毒CVB5的PCR方法，所以本文通過(guò)建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異的檢測(cè)

3、CVB5的巢式PCR方法，將其與其它腸道病毒，如Echo6、EV71、CVA16等進(jìn)行鑒別，也為以后CVB5感染的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了一種更為可靠的手段。
　　 方法:
　　 從GenBank下載河南分離株CVB5全基因序列，用DNAStar軟件進(jìn)行同源性比較，在同源性較高的區(qū)域選擇出引物設(shè)計(jì)的模板，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，用PrimerPremier5.0在VP1區(qū)設(shè)計(jì)了三對(duì)巢式PCR引物，并用Blast和Olig

4、o6.0軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)和分析評(píng)價(jià)。最終將這三對(duì)巢式PCR引物合成并進(jìn)行擴(kuò)增后，通過(guò)凝膠成像方法進(jìn)行驗(yàn)證確定最終選擇的引物。提取病毒標(biāo)準(zhǔn)株RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，并對(duì)其靈敏度、特異度和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終建立了一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)腸道病毒CVB5的巢式RT-PCR方法。用建立的巢式RT-PCR方法對(duì)新采集的212份病毒性腦炎患者樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與做為金標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離檢測(cè)方法進(jìn)行比較評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)

5、值。病原的確定通過(guò)將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序后，先用DNAStar軟件的SeqMan將測(cè)定到的核酸序列進(jìn)行人工輔助校對(duì)，再用NCBI軟件進(jìn)行同源性比較，與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì)分析，核酸序列比對(duì)分析利用DNAStar7.0完成。
　　 結(jié)果:
　　 1.以病毒標(biāo)準(zhǔn)株反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，最終確定兩輪擴(kuò)增反應(yīng)總體系均為50μl，包括PCR反應(yīng)液25μl、cDNA模板1μl、上下游引物各1μl、無(wú)RNA酶去

6、離子水22μl。在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中，取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物1μl作為模板。反應(yīng)條件為:94℃3min;94℃，30s，56℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán);72℃10min;4℃，∞。第二輪反應(yīng)條件除了將第一輪的30個(gè)循環(huán)改為25個(gè)循環(huán)外，其他與第一輪相同。
　　 2.方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果:敏感性:將CVB5標(biāo)準(zhǔn)株選用RD細(xì)胞進(jìn)行病毒效價(jià)滴定，然后10倍梯度倍比稀釋進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，成像結(jié)果顯示第一輪的靈敏度達(dá)到10TCID50，第二輪的靈

7、敏度達(dá)到10-4TCID50;特異性:將5株不同的CVB5毒株和Echo25、EV71等4株其他腸道病毒毒株及空白對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后，5株CVB5毒株兩輪成像結(jié)果均在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶，而其他毒株及陰性對(duì)照均無(wú)目的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期結(jié)果一致。重復(fù)性:分別用已建立的檢測(cè)方法將CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性腦炎病例樣本用已建立的檢測(cè)方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果均一致。
　　 3.分別用建立的巢式RT-PCR方法和