基于多種分析技術(shù)的胰腺癌與糖尿病血清代謝組學(xué)研究.pdf

1、胰腺癌（Pancreatic cancer）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占人類全身腫瘤的1-3％，在西方國(guó)家居惡性腫瘤死亡原因的第四位，早期診斷困難。胰腺癌與糖尿病有著密切關(guān)系，探索兩者發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系，將有助于了解胰腺癌的病因，并為提高癌癥早期診斷率提供依據(jù)。代謝組學(xué)從系統(tǒng)水平研究機(jī)體小分子代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，在研究疾病發(fā)病機(jī)制和早期診斷等方面有一定優(yōu)勢(shì)。本論文將加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）應(yīng)用于血漿代謝組學(xué)研究，證明了該技術(shù)高

2、效分離血漿內(nèi)源性代謝物的能力，以及作為胰腺癌早期診斷手段的可行性。進(jìn)一步分別應(yīng)用以UPLC/MS和GC/MS為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)技術(shù)，從整體上考察胰腺癌、糖尿病和正常人血清間的代謝物差異，發(fā)現(xiàn)可獲得較多兩種疾病間共有和特異性的標(biāo)志物，為將來全面理解兩種疾病在發(fā)病機(jī)制上的差異和聯(lián)系提供了一個(gè)新視角和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)，根據(jù)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有非線性的特點(diǎn)，探討了非線性人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)三組樣本進(jìn)行分類的能力，說明該技術(shù)有潛力用于大樣本量的模式識(shí)別。

3、>　　本論文主要內(nèi)容包括：
　　1、建立pCEC研究血漿代謝指紋圖譜的方法，考察該方法區(qū)分胰腺癌患者的能力。以反相色譜柱和梯度洗脫對(duì)血漿樣品進(jìn)行pCEC分離。通過考察流動(dòng)相組成、檢測(cè)波長(zhǎng)、酸改性劑和操作電壓對(duì)質(zhì)控（QC）血漿樣品分離情況的影響優(yōu)化色譜條件。通過對(duì)重復(fù)進(jìn)樣的QC樣品進(jìn)行考察，說明該方法重復(fù)性好、系統(tǒng)穩(wěn)定性高。另外，比較了pCEC-UV數(shù)據(jù)經(jīng)不同標(biāo)準(zhǔn)化方法預(yù)處理后，對(duì)正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型的影響。

4、研究發(fā)現(xiàn)，pCEC-UV分析得到的血漿代謝指紋圖譜能明顯表征出胰腺癌患者和正常人的代謝表型差異，結(jié)合有監(jiān)督模式識(shí)別，能夠有效的區(qū)分胰腺癌患者和健康對(duì)照組的血漿代謝輪廓。本研究說明pCEC-UV技術(shù)可以作為一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保、高效和相對(duì)簡(jiǎn)單的技術(shù)平臺(tái)用于疾病的血漿代謝譜研究，是一種潛在的早期診斷手段。
　　2、采用超高壓液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC Q-TOF MS）技術(shù)分析了20個(gè)胰腺癌患者、19個(gè)2型糖尿病患者和25個(gè)正

5、常人血清的代謝組學(xué)差異，結(jié)合非監(jiān)督的PCA方法，發(fā)現(xiàn)三組樣本的代謝譜有分離趨勢(shì)。進(jìn)一步利用有監(jiān)督的OPLS-DA方法能清楚地將三組樣本分開，說明相對(duì)于正常人而言，胰腺癌患者和糖尿病人的代謝譜均發(fā)生改變，并有明顯差異。根據(jù)精確分子量、同位素信息和MS/MS信息，按照差異代謝物的種類，對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定，尤其是對(duì)血清中檢測(cè)到的溶血磷脂酰膽堿（lysoPC）的同分異構(gòu)體進(jìn)行了全面鑒定。與正常人相比，胰腺癌患者血清中以甘氨鵝脫氧膽酸為代表的4

6、種膽汁酸明顯升高，12種lysoPC（包括部分同分異構(gòu)體）降低，花生四烯酸以及部分脂肪酸升高；糖尿病患者血清中同樣的12種lysoPC顯著降低，而花生四烯酸等游離脂肪酸降低。胰腺癌與糖尿病在磷脂代謝和脂肪酸代謝均發(fā)生了紊亂，但是lysoPC18:1同分異構(gòu)體的比例變化在兩種疾病中存在差異，提示將來通過對(duì)具體種類的lysoPC同分異構(gòu)體進(jìn)行定量分析可能會(huì)發(fā)現(xiàn)胰腺癌與糖尿病的特異性差異標(biāo)志物。
　　3、采用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）技

7、術(shù)分析了20個(gè)胰腺癌患者、19個(gè)2型糖尿病患者和25個(gè)正常人血清的代謝組學(xué)差異。以N-O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）為衍生試劑，采用兩步法對(duì)血清樣品進(jìn)行衍生，同時(shí)優(yōu)化了甲氧胺的加入量。結(jié)合PCA和OPLS-DA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別，得到了與UPLC-MS代謝組學(xué)分析類似的結(jié)果，能夠清晰的區(qū)分三組樣本的血清代謝組差異。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的差異物與UPLC-MS互補(bǔ)，主要為氨基酸類、糖類、膽固醇以及有機(jī)酸等物質(zhì)。與正常人相比，胰腺癌與糖

8、尿病患者的糖代謝、糖酵解以及部分氨基酸代謝均發(fā)生了不同程度的紊亂。亮氨酸、十六烷酸以及苯丙氨酸在胰腺癌組特異性上調(diào)，甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、脯氨酸、檸檬酸則在糖尿病患者血清中特異性下調(diào)，提示這些小分子物質(zhì)可能分別為兩種疾病的潛在特異性生物標(biāo)志物。
　　4、以UPLC/MS實(shí)驗(yàn)得到的26個(gè)差異物在各個(gè)樣本中的響應(yīng)強(qiáng)度為數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，采用非線性人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立多類型樣本的分類模型。通過試驗(yàn)比較不同隱含層數(shù)和隱含層結(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)收斂性及血清