肝郁證大鼠模型血清代謝組學(xué)研究.pdf

1、證候是中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病作為一種功能狀態(tài)變化的癥候群，是中醫(yī)學(xué)理論和臨床實(shí)踐的核心。辯證施治在幾千年的臨床實(shí)踐中不斷發(fā)展和驗(yàn)效，充分體現(xiàn)了整體觀和個(gè)體化的治療理念，是中醫(yī)學(xué)的精髓。因此，證本質(zhì)的研究對(duì)于中醫(yī)理論與臨床實(shí)踐的發(fā)展和中醫(yī)現(xiàn)代化具有極其重要的意義。 肝郁證是指由于肝的疏泄功能異常，疏泄不及而致氣機(jī)郁滯所表現(xiàn)的證候，見于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多種疾病，是中醫(yī)臟腑病證中常見的證候之一，也是中醫(yī)肝病發(fā)病學(xué)的基本證候。在不同疾病中，經(jīng)中醫(yī)辯證同

2、屬肝郁證的，施以疏肝理氣相應(yīng)方藥，這樣的“異病同治”確能取得較好療效。因此，肝郁證被認(rèn)為是多種疾病發(fā)展過程中的一種具有共性的“功能態(tài)”，研究肝郁證的實(shí)質(zhì)，不僅是中醫(yī)證本質(zhì)研究的重要內(nèi)容，更能為臨床多種疾病的診斷和防治提供新的思路和方法；通過肝郁證這一典型證候的研究，探索證本質(zhì)研究的合適方法，對(duì)闡釋中醫(yī)學(xué)的科學(xué)內(nèi)涵有實(shí)際意義。 繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展起來的代謝組學(xué)，是研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物變化的科學(xué)方法，它

3、迴避了復(fù)雜的生命調(diào)控過程，通過對(duì)生命體所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量、定性分析，給出最終的、整體的病理變化結(jié)果。同蛋白質(zhì)組學(xué)一樣，中醫(yī)學(xué)兩大特色——整體觀和辨證論治觀在代謝組學(xué)中也都有體現(xiàn)，通過代謝組學(xué)的方法有助于闡釋中醫(yī)“證”的本質(zhì)。 研究目的： 比較慢性束縛肝郁證大鼠模型與正常大鼠血清差異表達(dá)的代謝物，確定肝郁證的“代謝組學(xué)特征”和小分子標(biāo)志物；闡明肝郁證代謝物水平的物質(zhì)基礎(chǔ)并探討其實(shí)質(zhì)，為肝郁證本質(zhì)的系統(tǒng)研究提供科學(xué)

4、依據(jù)。建立證候研究的代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，為從代謝物水平探討中醫(yī)證本質(zhì)提供思路和方法。 研究方法： 1.慢性束縛肝郁大鼠模型的建立 動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，鼠齡5周，體重（150±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1天后隨機(jī)分為模型組（E組）、正常對(duì)照組（F組）、逍遙散+模型組（A組）和逍遙散+空白組（B組），每組各6只。F組3只1籠，其余3組單籠孤養(yǎng)。 模型建立：參照文獻(xiàn)，模擬中醫(yī)情志抑郁的病因

5、，將A、E組大鼠置于特制的束縛制動(dòng)筒內(nèi)，通過移動(dòng)插條逐步縮小大鼠活動(dòng)空間，調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的最小空間。每日開始時(shí)間隨機(jī)，每日束縛制動(dòng)1次，持續(xù)時(shí)間從第1天的4h逐漸增至每天6h，連續(xù)21d。A、E組大鼠在束縛制動(dòng)期間禁食、禁水。 藥物干預(yù)：A、B組大鼠根據(jù)正常成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠用藥量為10g/kg.d，根據(jù)大鼠個(gè)體體重每日上午8時(shí)給A、B組大鼠經(jīng)胃灌相應(yīng)藥量，E、F組大鼠同時(shí)以0.9%生理鹽水2ml灌

6、胃。 從行為學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查血漿皮質(zhì)酮、逍遙散干預(yù)后療效觀察等方面評(píng)價(jià)模型的可靠性。 2.肝郁證代謝組學(xué)初步研究 用基于1H NMR技術(shù)的代謝組學(xué)方法檢測(cè)模型組（E組）和正常對(duì)照組（F組）血漿代謝組分差異，分析其差異物質(zhì)與肝郁證可能存在的關(guān)系。 3.肝郁證方證的代謝組學(xué)研究 進(jìn)一步比較A、B、E、F四組大鼠血清代謝組分差異，尤其關(guān)注逍遙散對(duì)正常大鼠（B組）和模型大鼠（A組）血清代謝組分的影響，并與E

7、、F組間差異表達(dá)的代謝組分比較，從方證互參角度了解肝郁證中代謝組分的變化規(guī)律。 結(jié)果： 行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)E組大鼠開始表現(xiàn)為易激惹、掙扎，隨后表現(xiàn)為躲避、活動(dòng)減少和對(duì)外界刺激反應(yīng)減少，安靜時(shí)埋首、拱背，大便松散，皮色失去光澤；A組大鼠上述反應(yīng)較輕，而B、F組未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長(zhǎng)存在顯著性差異（P=0.010），E組生長(zhǎng)較為緩慢，A組服藥后體重增長(zhǎng)緩慢的情況得到改善。液體消耗實(shí)驗(yàn)提示各組間糖水偏好存在顯著性差異（P

8、<0.001），E組大鼠對(duì)糖水的偏好率小于其余三組。第22天血漿皮質(zhì)酮水平比較，各組間存在顯著性差異（P=0.0001）；濃度從高到低依次為E>A>B>F，且A、E組之間存在顯著性差異（p=0.005）。常規(guī)HE染色下，各組胃粘膜、腎上腺未見急性應(yīng)激的病理改變，與E組比較無明顯變化。四組間腎上腺體重指數(shù)比較存在顯著性差異（P=0.045），E組最高，A組有改善。分別從病因、證候、實(shí)驗(yàn)室病理改變和治療后的反應(yīng)四個(gè)方面驗(yàn)證慢性束縛肝郁證大鼠

9、模型的可靠性。 肝郁證代謝組學(xué)初步研究發(fā)現(xiàn)E組、F組之間血清代謝物存在差異，E組中含量升高的有血糖（Glucose）、肌酸（Cr），含量下降的有高密度脂蛋白（HDL）、3-羥基丁酸（3-HB）、谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、乳酸（Lac）、N-乙酰糖蛋白（Nac）、O-乙酰糖蛋白（Oac）、不飽和脂肪酸（UFA）、極低／低密度脂蛋白（VLDL/LDL）、磷酸膽堿（Pcho）和磷脂酰膽堿（PtdCho）。上述物質(zhì)的集合共同

10、構(gòu)成了肝郁證大鼠模型的代謝組學(xué)特征。這些物質(zhì)大多與機(jī)體能量代謝有關(guān)；此外，Gln、UFA、VLDL/LDL、Pcho和PtdCho是維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)的基本物質(zhì)，Gln轉(zhuǎn)化生成的谷胱甘肽和PtdCho還有非常重要的抗氧化、抗損傷作用；UFA、PtdCho、Glu與神經(jīng)系統(tǒng)高級(jí)功能相關(guān)；Gln、UFA、Pcho、Nac、Oac是維持機(jī)體正常免疫功能的基本物質(zhì)；Nac、Oac、UFA與血液流變學(xué)和凝血功能相關(guān)。這些物質(zhì)的變化反映了肝郁證狀態(tài)下

11、能量代謝紊亂、神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、免疫功能減弱、微循環(huán)障礙、體細(xì)胞活性及抗損傷修復(fù)減退的病理機(jī)制，并進(jìn)一步提示肝郁證存在腫瘤高發(fā)危險(xiǎn)，能導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶能力減退；提示可能會(huì)影響凝血功能。 進(jìn)一步對(duì)肝郁證方證進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)、分析：逍遙散對(duì)正常大鼠血清代謝組分有輕微影響，逍遙散干預(yù)后肝郁模型大鼠血清代謝譜有所變化，向正常組靠近。CPMG、LED實(shí)驗(yàn)得分圖顯示四組大鼠沿第一主成份明顯分開，提示代謝組分的變化幾乎是單向的。四組間兩兩比較得出

12、代謝物質(zhì)變化的方向和幅度，找出隨證候模型和相應(yīng)方劑治療后變化一致并趨于正常的物質(zhì)，剔除那些變化與方證無關(guān)的物質(zhì)，推測(cè)Lac、Cr、Glucose、3-HB、Glu、VLDL/LDL、PtdCho、UFA這8種物質(zhì)也許更能體現(xiàn)肝郁證模型大鼠血清代謝組學(xué)特征。 結(jié)論： 慢性束縛大鼠模型能夠較好的模擬肝郁證證候。通過對(duì)肝郁證大鼠模型的代謝組學(xué)研究，嘗試將中醫(yī)證候病機(jī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論聯(lián)系起來，其紐帶就是存在差異的物質(zhì)。中醫(yī)證候的生

13、物標(biāo)志物很可能不是單一物質(zhì)，而是差異物質(zhì)的集合，即“生物標(biāo)志物群”的概念，也許才能更好的用于疾病/證候的判別分析。從代謝組學(xué)去理解肝郁證：在涉及細(xì)胞新陳代謝的多種物質(zhì)改變基礎(chǔ)上，以神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、免疫功能減弱、微循環(huán)障礙、體細(xì)胞活性及抗損傷修復(fù)減退等非特異性表現(xiàn)的綜合癥；其對(duì)應(yīng)的代謝物水平物質(zhì)基礎(chǔ)就是包含PtdCho、3-HB、Gln、Glucose、UFA、Pcho等多種物質(zhì)在內(nèi)的生物標(biāo)志物譜的改變；以上結(jié)果為肝郁證本質(zhì)研究的系統(tǒng)生物