rAAV-FGF21及rAAV-FGF21-GLP1對(duì)2型糖尿病的治療研究.pdf

1、第一章，質(zhì)粒及病毒的鑒定
　　目的:檢測重組質(zhì)粒構(gòu)建的正確性以及其表達(dá)目的蛋白的情況，了解包裝的重組病毒的生物學(xué)活性。
　　方法:1.用限制性內(nèi)切酶(XbaⅠ、BamHⅠ)對(duì)重組質(zhì)粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)進(jìn)行酶切，凝膠電泳檢測其產(chǎn)物大小。2.用重組質(zhì)粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，收集其細(xì)胞培養(yǎng)上清，用Western Blotting及ELIS

2、A檢測其中FGF-21及GLP-1蛋白的表達(dá)。3.用rAAV-mCherry體外感染HepG2細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達(dá)以檢測其生物學(xué)活性。
　　結(jié)果:1.pAAV-FGF21經(jīng)酶切后，能檢測到兩條帶，分子量分別為5200bp和630bp左右，符合AAV載體片段和FGF21片段大小;pAAV-FGF21-GLP1經(jīng)酶切后，能檢測到兩條帶，分子量分別為5200bp和780bp左右，符合AAV載體片段和FGF21+GLP1片

3、段大小。2.經(jīng)pAAV-FGF21轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中能檢測到FGF-21蛋白;經(jīng)pAAV-FGF21-GLP1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中能檢測到FGF-21蛋白和GLP-1蛋白。3.用rAAV-mCherry感染細(xì)胞后可在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光。
　　結(jié)論:重組質(zhì)粒(pAAV-FGF21、pAAV-FGF21-GLP1)構(gòu)建正確，并且能在體外介導(dǎo)相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)。包裝的重組腺相關(guān)病毒具有生物學(xué)活性。
　　第二章，重組A

4、AV對(duì)2型糖尿病小鼠的治療
　　目的:評(píng)估rAAV-FGF21、rAAV-FGF21-GLP1對(duì)2型糖尿病小鼠的治療效果。
　　方法:對(duì)db/db小鼠進(jìn)行空腹血糖及空腹胰島素測定，以空腹血糖及HOMA-IR升高作為2型糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)。2型糖尿病db/db小鼠隨機(jī)分成4組，予以不同處理:A組（生理鹽水）、B組(空載體rAAV-mCherry)、C組(rAAV-FGF21)、D組（rAAV-FGF21-GLP1）;正常C57/B

5、L6小鼠作為H組（生理鹽水）。監(jiān)測各組小鼠空腹血糖、體重、進(jìn)食量、空腹胰島素。治療10周后處死小鼠，取肝臟組織用RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)，取胰腺組織用免疫熒光檢測胰島β細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果:1.實(shí)驗(yàn)中所有db/db小鼠均有高血糖及胰島素抵抗。2.與A組相比，D組小鼠空腹血糖、體重、進(jìn)食量、空腹胰島素明顯下降(P＜0.01)，而B組、C組則無明顯變化。3.在C組、D組小鼠肝臟組織中能檢測到相應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因的表達(dá)。4.免疫熒光