FGF21在STZ和高脂誘導糖尿病心肌病發(fā)病中的作用及其分子機制研究.pdf

1、目的:FGF21是一種主要由肝臟分泌的內(nèi)分泌因子，其主要作用為調(diào)節(jié)糖脂代謝。動物實驗證實FGF21具有降低血糖、抑制胰島素敏感性、調(diào)節(jié)異常血脂等生物功效，但其在糖尿病心肌病中的作用機制不明。本論文主要采用小劑量STZ+高脂飲食方法造成小鼠糖尿病心肌病模型，觀察FGF21基因缺失對STZ+高脂飼料誘導糖尿病小鼠心肌病變的影響，并在細胞水平上進一步研究FGF21對高唐刺激的H9C2心肌細胞的保護作用。
　　方法:
　　(1)ST

2、Z+高脂飼料造成小鼠糖尿病模型及小鼠體內(nèi)FGF21的變化
　　取8只8周齡雄性C57BL/6j野生型(WT)小鼠隨機分為兩組，其中一組腹腔注射0.2 ml STZ（50 mg/kg），再高脂飼料喂養(yǎng)10周，另一組，腹腔注射相同體積PBS為對照，再普通飼料喂食10周，分別在注射前(0 d)及注射后7，30，60 d固定時間檢測兩組小鼠的血糖水平，記錄小鼠體重變化。注射10周后處死上述兩組老鼠，收集其血樣及組織。觀察STZ+高脂飼料處

3、理后小鼠糖尿病病變狀況:使用血糖儀檢測隨機血糖、H&E染色觀察組織形態(tài)學變化;同時，采用ELISA方法觀察STZ+高脂飼料處理后小鼠血清及肝臟、胰腺、脂肪、心臟組織中FGF21的變化狀況，并采用Q-PCR的方法檢測小鼠心肌組織中FGF21 mRNA表達的水平變化。
　　(2) FGF21基因缺失對STZ+高脂飼料誘導的糖尿病心肌病變的影響
　　取8只8周齡雄性C57BL/6j FGF21基因缺失(FGF21 KO)小鼠隨機分

4、成A、B兩組，同時取8只相同年齡及背景的C57BL/6j野生型小鼠亦隨機分成C、D兩組。A、C兩組小鼠腹腔注射0.2 ml STZ(50 mg/kg)，再高脂飼料喂養(yǎng)10周，C、D兩組小鼠腹腔注射相同體積PBS為對照，再普通飼料喂食10周。分別在注射前(0 w)及注射后每周固定時間觀察四組小鼠的血糖水平變化并進行葡萄糖耐受實驗。注射STZ后飼養(yǎng)10周，處死收集其血樣及心肌等組織，分別進行如下處理:1）采用H&E染色觀察心肌組織形態(tài)學的改

5、變;2）采用Q-PCR的方法檢測小鼠心肌組織中炎癥相關因子TNF-α，IL-1b;3)采用Sirus染色觀察心肌組織纖維化病變狀況，同時觀察心肌組織中纖維化相關因子ColⅠ，MHC-β mRNA表達水平變化;4）采用免疫組化檢測凋亡早期蛋白caspase3活性的變化。
　　(3) FGF21抗高糖引發(fā)的H9C2心肌細胞損傷的分子作用機制研究
　?、佴?klotho在H9C2細胞株中的表達狀況
　　采用Q-PCRDE方法

6、檢測原代脂肪細胞分化的脂肪細胞和H9C2細胞株中β-klotho mRNA表達水平;同時，采用Western blot的方法檢測原代脂肪細胞分化的脂肪細胞和H9C2細胞株中β-klotho的蛋白水平。
　?、贔GF21對高糖刺激H9C2細胞后TGF-β，ROS表達水平影響
　　首先對細胞進行分組，處理如下:i.含5.5 mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基處理作為對照組;ii.含33 mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基作為造模組;iii.含

7、33 mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基合用10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml FGF21作為梯度給藥組。培養(yǎng)36 h后收集細胞RNA，采用Q-PCR的方法檢測細胞中TGF-β mRNA表達水平，并尋找到FGF21最適作用濃度。其次，采用上述方法，分別用5.5mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基，33mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基及33mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基合用最適濃度FGF21刺激心肌細胞，培養(yǎng)6h后，找到采用流式細胞儀觀察細胞內(nèi)ROS水平

8、。
　　③FGF21對高糖刺激H9C2細胞后AMPK、Akt磷酸化水平影響
　　對細胞進行分組，處理如下:i.含5.5 mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基處理作為對照組;ii.含33 mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基作為造模組;iii.含33mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基合用10 ng/ml，50 ng/ml，100 ng/ml FGF21作為梯度給藥組。作用6h后收集蛋白，采用Western blot的方法檢測p-AMPK、AMPK、

9、p-Akt、Akt蛋白水平。
　　④AMPK磷酸化與ROS之間關系探討
　　對細胞進行分組，處理如下:i.含5.5 mM葡萄糖DMEM培養(yǎng)基處理作為對照組;ii.含33 mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基作為造模組;iii.含33mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基合用最適濃度FGF21作為給藥組;iv.含33 mM葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基合用最適濃度FGF21作為給藥組加入AMPK磷酸化抑制劑Compound C作為處理組，置于細

10、胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6h后收集細胞，觀察細胞內(nèi)ROS水平。
　　結果:
　　(1) FGF21在STZ+高脂飼養(yǎng)誘導小鼠的糖尿病病變過程中顯著上調(diào)
　　STZ+高脂飼料作用后的WT小鼠的體重持續(xù)升高，而PBS+普通飼料處理的WT小鼠則維持不變;在0d，7d，30d，60d檢測的隨機血糖值也顯示 STZ+高臘誘導后小鼠血糖顯著升高(p＜0.01); IGTT的實驗結果顯示，糖尿病模型組的糖耐受明顯受損(p＜0.001);與對照

11、組相比，模型組老鼠的肝臟和脂肪組織增重。心肌組織HE染色結果表明，STZ+高脂飼料誘導后，心肌細胞紋理紊亂。同時，ELISA結果顯示，兩組小鼠血清中FGF21的蛋白水平也存在差異，STZ+高脂飼料處理后血清FGF21蛋白含量增加。心肌組織中FGF21蛋白含量沒有顯著性變化，但FGF21主要來源組織如胰腺，脂肪中FGF21蛋白表達水平上調(diào)，與對照組相比，存在顯著性差異(p＜0.05);同時，心肌細胞中FGF21的mRNA表達水平也呈現(xiàn)一致

12、的趨勢。
　　(2) FGF21基因缺失加重STZ+高脂飼養(yǎng)誘導的小鼠糖尿病心肌病的病變狀況
　　與STZ+高脂處理的WT小鼠相比，F(xiàn)GF21 KO小鼠血清中的隨機葡萄糖水平明顯升高(p＜0.05)，糖耐受受損;組織形態(tài)學結果顯示FGF21缺失后心肌細胞紊亂程度加劇;反映炎癥的指標TNF-α，IL-1b在FGF21 KO的老鼠中也顯著上升(p＜0.05);纖維化指標Sirus染色結果顯示FGF21基因缺失后胰腺組織膠原蛋白沉

13、積量顯著增多，同樣，F(xiàn)GF21 KO小鼠心臟組織中的ColⅠ、MHC-β的mRNA表達水平存在顯著變化，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。免疫組化結果顯示FGF21基因缺失活化了caspase3的水平。
　　(3) FGF21通過激活AMPK信號通路抑制高糖對H9C2心肌細胞的損傷
　　實驗結果顯示，心肌細胞中能表達β-klotho。與低糖處理的對照組細胞相比，高糖刺激顯著上調(diào)了纖維化指標TGF-β mRNA水平(

14、p＜0.05)，而用不同濃度FGF21進行給藥后，TGF-β水平下調(diào)，尤其在50 ng/ml下調(diào)作用最為顯著(p＜0.05)。同時，H9C2細胞高糖處理后， AMPK磷酸化水平降低，用不同濃度FGF21處理后其磷酸化水平上升，亦是在50ng/mlFGF21處理后作用最為明顯(p＜0.05)。流式結果顯示，50ng/ml的FGF21能有效地逆轉高糖誘導的ROS上調(diào)的表達(p＜0.05)。而合用AMPK磷酸化抑制劑后，ROS的表達又上調(diào)(p