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文檔簡介
1、基因工程酵母菌在食品工業(yè)中的應(yīng)用逐漸普遍,但重組菌抗生素抗性標(biāo)記的存在對食品安全具有潛在隱患。此外,較低的生產(chǎn)成本、簡單方便的下游操作技術(shù)和高水平的表達(dá)量等是工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白必須具備的特點(diǎn)。
針對這些問題,本課題根據(jù)半乳糖—葡萄糖對GAL基因家族誘導(dǎo)—抑制效應(yīng)以及GAL4P對GAL基因的調(diào)控機(jī)制,采用同源重組技術(shù)分步敲除了工業(yè)多倍體釀酒酵母MS—1染色體上的GAL1基因,并將GAL4基因整合到GAL1基因位點(diǎn),構(gòu)建了
2、不同GAL基因型的重組酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21。同時,選用α—半乳糖苷酶作為食品級選擇標(biāo)記、β—1,3—1,4—葡聚糖酶作為報告基因構(gòu)建了在GAL1啟動子和MFα1信號肽控制指導(dǎo)下的食品級分泌表達(dá)載體YGMPA—PM;并以α—凝集素C—端320個氨基酸為錨定序列,構(gòu)建了能夠展示表達(dá)β—1,3—1,4—葡聚糖酶的食品級展示表達(dá)載體YGMPNA—PM。將構(gòu)建的載體和不同GAL基因型的重組酵母相結(jié)合,得到了適合工業(yè)化生產(chǎn)的
3、食品級高效分泌表達(dá)系統(tǒng)和食品級高效展示表達(dá)系統(tǒng)。主要研究結(jié)果如下:
擴(kuò)增了GAL4結(jié)構(gòu)基因全長序列,并構(gòu)建了包含GAL4基因+KanMX表達(dá)盒的模板質(zhì)粒PMD18—FGK。通過同源重組以GAL4+KanMX表達(dá)盒替換了工業(yè)三倍體酵母MS—1的三個等位的GAL1基因中的一個,得到具有雙GAL4的重組酵母。以KanMX為敲除框架,敲除了MS—1染色體上的一個GAL1基因。利用LFH原理,設(shè)計了另外兩套基因敲除框架KanMX—G
4、AL1s和GAL1+KanMX,依次敲除了雙GAL4重組菌株染色體上剩余的兩個GAL1等位基因??紤]到重組菌株應(yīng)用的安全性,利用Cre/loxP系統(tǒng)切除了構(gòu)建重組釀酒酵母菌株時使用的KanMX抗性表達(dá)盒,并通過傳代使Zeocin抗性質(zhì)粒pSH47/ZEO丟失,得到不同GAL基因型的重組酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21。其中,重組菌株GQ21染色體上三個GAL1基因全部缺失,且其中一個GAL1基因位點(diǎn)被整合了一個GAL4基因拷
5、貝。
對不同GAL基因型的重組酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21在含有不同碳源的培養(yǎng)基中的生長、發(fā)酵性能以及抗性和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了測試。結(jié)果表明,重組酵母的GAL基因型在傳代過程中保持穩(wěn)定,沒有發(fā)生回復(fù)突變且抗性基因已經(jīng)被徹底刪除。GAL1基因的缺失對重組菌株對葡萄糖的利用有輕微地影響。不同的培養(yǎng)方式影響重組酵母對半乳糖的利用。在YPG培養(yǎng)基中,GAL1基因敲除對酵母利用半乳糖的影響并不明顯, MS—1、SG1、
6、DG115在20h內(nèi)將培養(yǎng)基中的半乳糖全部消耗完畢,DPG65則在26h內(nèi)將半乳糖利用完畢。在YPGL培養(yǎng)基中,MS—1、SG1、DG115和DPG65利用完半乳糖的時間分別為20h、44h、44h和68h。在兩種培養(yǎng)模式中,GQ21培養(yǎng)基中的半乳糖濃度一直維持不變,表明GAL1基因確實(shí)已經(jīng)被完全敲除。GAL1基因的敲除和GAL4基因拷貝的增加沒有改變重組菌株的熱致死溫度。重組菌株和對照菌株的熱致死溫度仍然是54℃。
構(gòu)建
7、了PGK1啟動子控制下的α—半乳糖苷酶表達(dá)單元,并將此表達(dá)單元克隆到多拷貝質(zhì)粒YEPlac181上構(gòu)建了食品級克隆載體YPM。YPM轉(zhuǎn)化酵母后得到的重組子可以在以蜜二糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長,并能在涂有X—α—gal的培養(yǎng)上顯藍(lán)色,表明α—半乳糖苷酶已經(jīng)被有效表達(dá)。重組酵母/YPM在YPD培養(yǎng)基和MSD培養(yǎng)基中表達(dá)的α—半乳糖苷酶酶活最高為104U/ml和41.72U/ml;對照菌株安琪酵母表達(dá)的α—半乳糖苷酶存在蜜二糖/葡萄糖誘導(dǎo)—
8、抑制效應(yīng),在YPD培養(yǎng)基和MSD培養(yǎng)基中的最高酶活為29.79U/ml和266.38U/ml。在MSD培養(yǎng)基中,安琪酵母12h進(jìn)入對數(shù)生長期,32h進(jìn)入穩(wěn)定期;重組酵母YPM在68h后才開始快速生長,164h后進(jìn)入穩(wěn)定期。兩者在YPD培養(yǎng)基中的生長性能一致,8h進(jìn)入對數(shù)生長期,32h達(dá)到穩(wěn)定期。
擴(kuò)增了GAL1啟動子、MFα1信號肽以及ADH1終止子基因序列,以β—1,3—1,4—葡聚糖酶為報告基因在克隆載體YPM的基礎(chǔ)上
9、構(gòu)建了食品級分泌表達(dá)載體YGMPA—PM。以α—半乳糖苷酶為篩選標(biāo)記,將載體YGMPA—PM轉(zhuǎn)入所構(gòu)建的重組酵母菌株SG1、DG115、DPG65和GQ21以及MS—1,在蜜二糖平板(MSD)挑選出了轉(zhuǎn)化子。測定不同GAL基因型酵母中β—1,3—1,4—葡聚糖酶的表達(dá)水平。結(jié)果表明,SG1、DG115、DPG65和GQ21的β—1,3—1,4—葡聚糖酶最高酶活分別為1523.48U/ml、2480.43U/ml、3161.53U/ml和
10、3991.00U/ml,為MS—1(846.37U/ml)的1.8倍、2.93倍、3.73和4.72倍,說明酵母染色體上GAL1基因的敲除和GAL4基因拷貝的增加確實(shí)有利于提高外源蛋白表達(dá)的水平。重組分泌表達(dá)的β—1,3—1,4—葡聚糖酶的最適溫度為40℃,最適pH為6.0。50℃保溫2h后β—1,3—1,4—葡聚糖酶殘留酶活為51.90%;60℃保溫2h后的活力下降為初始酶活的20.14%。在pH4—6的范圍內(nèi)于4℃放置24h,酶活仍
11、能保持80%以上。
擴(kuò)增了編碼α—凝集素C—末端320個氨基酸的基因序列并在載體YGMPA—PM的基礎(chǔ)上構(gòu)建了食品級展示表達(dá)載體YGMPNA—PM。將其與不同GAL基因型的重組酵母相結(jié)合構(gòu)建了食品級展示表達(dá)系統(tǒng)。此展示表達(dá)系統(tǒng)將β—1,3—1,4—葡聚糖酶成功展示表達(dá)在釀酒酵母細(xì)胞表面。通過平板鑒定和酶活測定確證了β—1,3—1,4—葡聚糖酶的正確定位。SG1、DG115、DPG65和GQ21展示表達(dá)的β—1,3—1,4—
12、葡聚糖酶最高酶活分別為84.98U/ml、118U/ml、161.55U/ml和201.87U/ml,分別為MS—1(45.10U/ml)的1.88倍、2.62倍、3.56倍和4.48倍。展示表達(dá)的β—1,3—1,4—葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。最適溫度變?yōu)?0℃,熱穩(wěn)定性也被增強(qiáng)。50℃保溫3h對酶活幾乎沒有影響;60℃保溫1h殘留酶活為初始酶活的129.2%,60℃保溫3h后的酶活為初始酶活的64.6%。70℃保溫1h,酶活增加到初
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