腸出血性大腸埃希菌O157-H7 LAMP檢測(cè)方法的建立及嗜酸乳桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 腸出血性大腸埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是一種新型的食源性致病菌，主要經(jīng)食品傳播，引起食物中毒，臨床主要表現(xiàn)為出血性腸炎( hemorrhagic colitis，HC)，以及血栓性血小板減少性紫癜（thrombotic thromobocytopenie porpura，TTP）和溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremi

2、c syndrome, HUS)等。
　　 自1982年美國(guó)首次暴發(fā)EHEC O157∶H7感染后，世界各地相繼出現(xiàn)散發(fā)和暴發(fā)性流行性病例，致病性和致死性較高。1986年，我國(guó)首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到EHEC O157∶H7。目前，已有10多個(gè)省份從食品、家禽家畜和腹瀉患者糞便中分離到EHEC O157∶H7。EHEC O157∶H7嚴(yán)重威脅到社會(huì)公共衛(wèi)生和人類健康。因此，快速檢測(cè)和有效防治EHEC O157∶H7感染一直

3、是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的一大難題。
　　 傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法成本低，被廣泛接受，但需分離培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定等，較為費(fèi)時(shí)。PCR技術(shù)是近年來(lái)快速檢測(cè)EHEC O157∶H7的方法，但需要特殊的儀器，檢測(cè)成本高，在特異性、簡(jiǎn)便性等方面存在不足[5]。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)EHEC O157∶H7感染的流行病學(xué)調(diào)查和防治工作十分重要。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal a

4、mplification，LAMP）是日本學(xué)者Notomi等建立的一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理是，針對(duì)靶基因的6或8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4或6種特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件（約65℃）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP能夠高效、快速、靈敏、特異地?cái)U(kuò)增靶DNA，操作簡(jiǎn)便，成本低，適于大規(guī)模樣品的檢測(cè)和基層單位推廣應(yīng)用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、病原微生物檢測(cè)以及動(dòng)物胚胎的性別鑒

5、定等。
　　 本研究以EHEC O157∶H7的rfbE基因(GenBank:S83460.1)為靶序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer4.0設(shè)計(jì)LAMP引物，對(duì)各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立LAMP反應(yīng)體系。同時(shí)進(jìn)行PCR檢測(cè)，比較這兩種方法的靈敏度、特異性和對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果，以證實(shí)LAMP的現(xiàn)實(shí)可行性。
　　 針對(duì)EHEC O157∶H7感染，目前臨床上主要以預(yù)防和支持療法為主，尚缺乏特效的治療藥物

6、。采用抗生素療法，可能導(dǎo)致EHEC O157∶H7的細(xì)胞壁溶解，促進(jìn)致死性志賀毒素(Shiga toxin，Stx)的釋放，加劇患者并發(fā)溶血性尿毒綜合癥的危險(xiǎn)性。可見(jiàn)，研制出安全、有效的疫苗，對(duì)預(yù)防EHEC O157∶H7感染具有重要意義。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)EHEC O157∶H7的疫苗研究主要集中在多糖結(jié)合疫苗、細(xì)菌ghost疫苗、基因工程亞單位疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗和Stx類毒素疫苗等，雖然取得一定的進(jìn)展，有的已進(jìn)入臨床實(shí)

7、驗(yàn)，但也存在一些缺陷。迄今為止，尚無(wú)理想的疫苗推廣應(yīng)用。
　　 近年來(lái)，乳酸菌(Lactic acid bacteria)作為載體表達(dá)和傳遞目的抗原的研究備受關(guān)注。該菌安全、無(wú)毒，被公認(rèn)為安全級(jí)微生物（GRAS，generaly recognizeas safe）。隨著乳酸菌各類表達(dá)調(diào)控元件的分離，相繼發(fā)展了一系列適用于乳酸菌的克隆載體、表達(dá)載體、整合載體，而乳酸菌食品級(jí)高效表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用則是該領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)。因此，

8、本研究擬構(gòu)建食品級(jí)嗜酸乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，作為EHEC O157∶H7活載體疫苗的抗原投遞系統(tǒng)，添加至動(dòng)物飼料中以免疫動(dòng)物，從源頭上控制EHEC O157∶H7感染，保證食品安全。在EHECO157∶H7感染暴發(fā)流行期間，免疫易感人群，有效控制疾病的蔓延。
　　 乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)必須具備以下條件:
　　 1、載體必須是食品級(jí)的，不得含有非食品級(jí)功能性DNA片段，主要是抗生素編碼基因;
　　 2、表達(dá)宿主必須是安全

9、的食品級(jí)微生物;
　　 3、誘導(dǎo)物必須是食品級(jí)的，如乳鏈菌肽、乳糖、嘌呤、嘧啶、蔗糖等可被人食用的物質(zhì)。
　　 本項(xiàng)研究選用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）作為外源基因表達(dá)的宿主菌，具有以下特點(diǎn):
　　 1、該菌是人和動(dòng)物胃腸道內(nèi)正常菌群（益生菌），安全無(wú)毒;
　　 2、可合成和分泌外源目的蛋白;
　　 3、能黏附定植于黏膜上皮細(xì)胞，與黏膜免疫系統(tǒng)直接接觸，誘發(fā)有效

10、的黏膜免疫應(yīng)答，在第一時(shí)間抵御病原微生物的感染;
　　 4、無(wú)需大量培養(yǎng)細(xì)菌或純化目的抗原;
　　 5、研制成酸奶，以口服方式免疫接種。
　　 可見(jiàn)，嗜酸乳桿菌是理想的基因工程活載體疫苗的表達(dá)系統(tǒng)。
　　 利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的原理，用嗜酸乳桿菌LacF基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳桿菌（LacF-突變株）和半乳糖苷酶互補(bǔ)型載體（LacF+質(zhì)粒），構(gòu)成乳糖誘導(dǎo)的食品級(jí)嗜酸乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，為

11、研制預(yù)防EHECO157∶H7感染的食品級(jí)活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 二、研究方法
　　 1、根據(jù)EHEC O157∶H7的rfbE基因序列（GenBank: S83460.1）的保守區(qū)，設(shè)計(jì)出特異的LAMP引物，對(duì)各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立25μL的LAMP反應(yīng)體系。
　　 2、以39株實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA為模板，建立LAMP與PCR法檢測(cè)方法，并對(duì)比兩者的特異性;將過(guò)夜培養(yǎng)的EHEC O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行

12、稀釋，分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增，比較兩者的靈敏度。
　　 3、在待檢的32份豬肉樣品（EHEC O157∶H7陰性）中，取3份樣品用EHEC O157∶H7進(jìn)行接種，隨后做LAMP和PCR檢測(cè)，并與國(guó)標(biāo)法進(jìn)行比較。
　　 4、從嗜酸乳桿菌ATCC4356染色體基因組中擴(kuò)增出LacF基因，并連接到PMD-19 T，擴(kuò)增出含有LacF兩端同源重組序列的重組子，并連接至PUC-19。將突變體LacF經(jīng)PCR擴(kuò)增后，連接至上

13、述載體，進(jìn)行LacF無(wú)義序列的替換(PUC-19∶△LacF)。將△LacF經(jīng)過(guò)T-A克隆后，亞克隆到敲除載體PBR322，鑒定后電轉(zhuǎn)化至嗜酸乳桿菌，印章法篩選出突變株，并行Southern鑒定。
　　 5、以pNZ9530質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增RepA-RepC復(fù)制子和nisin啟動(dòng)子Pnis，連接至骨架質(zhì)粒pIlac，人工合成MCS多克隆位點(diǎn)，并克隆至以上質(zhì)粒，最后將LacF克隆至該載體，構(gòu)建成以LacF作為選擇標(biāo)記的半乳糖苷酶互

14、補(bǔ)型質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至上一步構(gòu)建的突變株，觀察其在乳糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。
　　 三、結(jié)果
　　 1、成功建立優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系。
　　 2、LAMP法檢出EHEC O157∶H7的特異性較PCR法高，LAMP的檢測(cè)限為101cfu/ml，比PCR高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　 3、對(duì)于實(shí)際樣品，LAMP和PCR與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致，均可檢出3份EHECO157∶H7陽(yáng)性樣品。
　　 4、本實(shí)驗(yàn)獲得La

15、cF缺陷同源性片段△LacF，成功構(gòu)建重組敲除載體PBR322-△LacF，經(jīng)篩選與鑒定，獲得半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳桿菌。
　　 5、成功構(gòu)建以LacF作為選擇標(biāo)記的半乳糖苷酶互補(bǔ)型質(zhì)粒，將該載體電轉(zhuǎn)化至上述突變株，并在乳糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，突變株恢復(fù)了生長(zhǎng)，表明半乳糖苷酶互補(bǔ)缺陷型嗜酸乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。
　　 四、結(jié)論
　　 通過(guò)優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，成功建立檢測(cè)EHEC O157∶H7的LAMP技

16、術(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)肉眼即能觀察到白色沉淀，加入SYBR GreenⅠ后在紫外照射下呈強(qiáng)熒光，且擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后能觀察到特異性的梯度條帶。LAMP技術(shù)的特異性和靈敏度均優(yōu)于PCR法。在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，兩種方法均可檢出EHEC O157∶H7陽(yáng)性樣品，與國(guó)標(biāo)法一致，表明LAMP可簡(jiǎn)便、快速、高度特異地檢出EHEC O157∶H7，適于大規(guī)模現(xiàn)場(chǎng)樣品的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，適宜于基層單位推廣應(yīng)用。
　　 利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)的原理，