陽(yáng)離子抗菌肽在大腸桿菌及釀酒酵母中高效表達(dá)體系構(gòu)建.pdf

1、陽(yáng)離子抗菌肽G13是Granulysin中，含19個(gè)氨基酸殘基肽段，對(duì)細(xì)菌有抑菌活性而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒，有重要研究?jī)r(jià)值。抗菌肽的生產(chǎn)以基因工程為主要手段，目前基因工程表達(dá)抗菌肽的體系主要包括真核和原核表達(dá)體系，其中原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌表達(dá)體系為主。由于抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒性及自身易被蛋白酶降解，因此原核表達(dá)主要采用融合表達(dá)技術(shù)，而切割融合頭一直以來(lái)都是抗菌肽融合表達(dá)的一個(gè)重步驟。酶法切割成本很高;溴化氫有劇毒，用其溴化氰切割會(huì)給科研和生

2、產(chǎn)帶來(lái)諸多不便。我們?cè)趐ThiohisA-G13載體中的融合頭與抗菌肽之間添加Asp-Pro酸敏感位點(diǎn)，去除原來(lái)的Met（溴化氫切割位點(diǎn)）構(gòu)建了pThiohisA-G13-C質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了重組蛋白的可溶性表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體經(jīng)PB緩沖液懸浮后用高壓均質(zhì)機(jī)在80Mpa下進(jìn)行破碎，其上清加入13％的乙酸于50℃孵育72h，成功地切割了融合蛋白獲得了重組G13結(jié)構(gòu)域。同時(shí)還研究了不同質(zhì)量分

3、數(shù)的硫酸銨及不同濃度的TCA溶液除雜蛋白效果。水解上清經(jīng)過(guò)硫酸銨和TCA分級(jí)沉淀，用PB緩沖液溶解經(jīng)陽(yáng)離子交換層析，得到純化的陽(yáng)離子抗菌肽G13結(jié)構(gòu)域。Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化的G13在4.1 kDa處呈單一條帶，經(jīng)bandscan掃描G13結(jié)構(gòu)域純度達(dá)到98％。質(zhì)譜分析證明了純化蛋白為G13結(jié)構(gòu)域，G13結(jié)構(gòu)域的圓二色譜分析表明，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲形式存在，當(dāng)用3％SDS或接近其等電點(diǎn)的緩沖液

4、來(lái)模擬細(xì)胞膜環(huán)境時(shí)，出現(xiàn)了α-螺旋結(jié)構(gòu)。瓊脂糖擴(kuò)散法檢測(cè)表明重組陽(yáng)離子抗菌肽G13對(duì)大腸桿菌DH5α及枯草芽孢桿菌均具有抑菌活性。
　　本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)抗菌肽真核表達(dá)進(jìn)行了研究，成功地對(duì)pYES2質(zhì)粒的GAL1啟動(dòng)子進(jìn)行改造，去除葡萄糖抑制效應(yīng)相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因，構(gòu)建了牛乳鐵蛋白肽(Lactoferricin Bovine，LfcinB)的真核表達(dá)質(zhì)粒M-pYES2-α-LfcinB，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增。提取純化重組質(zhì)

5、粒并將其電擊轉(zhuǎn)化入釀酒酵母宿主菌INVSc1中，通過(guò)尿嘧啶缺陷篩選培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，接種于尿嘧啶缺陷選擇培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，添加半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。收集濃縮誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行Trincine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)，證實(shí)目的蛋白的存在。此外，還研究了不同誘導(dǎo)溫度及時(shí)間對(duì)LfcinB的影響，實(shí)現(xiàn)了LfcinB在釀酒酵母中的高效、快速分泌表達(dá)，并在很大程度上解決了葡萄糖抑制效應(yīng)問(wèn)題，獲得有活性的重組抗菌肽。首次在4h時(shí)就檢測(cè)到LfcinB