陽離子抗菌肽在大腸桿菌及釀酒酵母中高效表達體系構(gòu)建.pdf

1、陽離子抗菌肽G13是Granulysin中，含19個氨基酸殘基肽段，對細菌有抑菌活性而對動物細胞無毒，有重要研究價值?？咕牡纳a(chǎn)以基因工程為主要手段，目前基因工程表達抗菌肽的體系主要包括真核和原核表達體系，其中原核表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達體系為主。由于抗菌肽對宿主細胞的毒性及自身易被蛋白酶降解，因此原核表達主要采用融合表達技術(shù)，而切割融合頭一直以來都是抗菌肽融合表達的一個重步驟。酶法切割成本很高;溴化氫有劇毒，用其溴化氰切割會給科研和生

2、產(chǎn)帶來諸多不便。我們在pThiohisA-G13載體中的融合頭與抗菌肽之間添加Asp-Pro酸敏感位點，去除原來的Met（溴化氫切割位點）構(gòu)建了pThiohisA-G13-C質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了重組蛋白的可溶性表達。誘導(dǎo)表達后的菌體經(jīng)PB緩沖液懸浮后用高壓均質(zhì)機在80Mpa下進行破碎，其上清加入13％的乙酸于50℃孵育72h，成功地切割了融合蛋白獲得了重組G13結(jié)構(gòu)域。同時還研究了不同質(zhì)量分

3、數(shù)的硫酸銨及不同濃度的TCA溶液除雜蛋白效果。水解上清經(jīng)過硫酸銨和TCA分級沉淀，用PB緩沖液溶解經(jīng)陽離子交換層析，得到純化的陽離子抗菌肽G13結(jié)構(gòu)域。Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化的G13在4.1 kDa處呈單一條帶，經(jīng)bandscan掃描G13結(jié)構(gòu)域純度達到98％。質(zhì)譜分析證明了純化蛋白為G13結(jié)構(gòu)域，G13結(jié)構(gòu)域的圓二色譜分析表明，其二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊及無規(guī)卷曲形式存在，當(dāng)用3％SDS或接近其等電點的緩沖液

4、來模擬細胞膜環(huán)境時，出現(xiàn)了α-螺旋結(jié)構(gòu)。瓊脂糖擴散法檢測表明重組陽離子抗菌肽G13對大腸桿菌DH5α及枯草芽孢桿菌均具有抑菌活性。
　　本實驗同時對抗菌肽真核表達進行了研究，成功地對pYES2質(zhì)粒的GAL1啟動子進行改造，去除葡萄糖抑制效應(yīng)相關(guān)的負調(diào)控基因，構(gòu)建了牛乳鐵蛋白肽(Lactoferricin Bovine，LfcinB)的真核表達質(zhì)粒M-pYES2-α-LfcinB，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進行擴增。提取純化重組質(zhì)

5、粒并將其電擊轉(zhuǎn)化入釀酒酵母宿主菌INVSc1中，通過尿嘧啶缺陷篩選培養(yǎng)基篩選陽性克隆，接種于尿嘧啶缺陷選擇培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，添加半乳糖誘導(dǎo)表達目的蛋白。收集濃縮誘導(dǎo)后的蛋白進行Trincine-SDS-PAGE電泳檢測，證實目的蛋白的存在。此外，還研究了不同誘導(dǎo)溫度及時間對LfcinB的影響，實現(xiàn)了LfcinB在釀酒酵母中的高效、快速分泌表達，并在很大程度上解決了葡萄糖抑制效應(yīng)問題，獲得有活性的重組抗菌肽。首次在4h時就檢測到LfcinB