Lactococcus lactis食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及銅綠假單胞菌融合外膜蛋白的表達(dá).pdf

1、乳酸菌是在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的微生物，用乳酸菌構(gòu)建以非抗生素抗性為選擇標(biāo)記的食品級(jí)載體的研究越來越為人們所關(guān)注。 NICE(TheNisin-Controlled Expression)系統(tǒng)是有效的食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。乳酸菌NICE系統(tǒng)是在乳鏈菌肽誘導(dǎo)下由nisA啟動(dòng)子控制目的基因的表達(dá)，含nisR和nisK的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。由于NICE系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑、宿主菌和載體都是食品級(jí)的，構(gòu)建乳酸菌NICE系統(tǒng)食品級(jí)

2、表達(dá)載體，將集益生菌生物功能和外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性于一體，在食品和醫(yī)藥方面有著很好的應(yīng)用前景。 在目的蛋白生產(chǎn)和發(fā)酵中，由于乳酸菌分泌表達(dá)可使乳酸菌生產(chǎn)的異源蛋白質(zhì)前體避免水解，異源蛋白質(zhì)表達(dá)量更高，以同源的乳酸球菌SPUsp45指導(dǎo)目的蛋白的分泌表達(dá)并且目的基因與SPUsp45，Nuc和LEISSTCDA的融合體可提高分泌表達(dá)效率，因而乳酸菌分泌表達(dá)更有意義。 本研究利用食品級(jí)a-aga選擇標(biāo)記代替抗生素抗性選擇標(biāo)記，

3、并利用nisA啟動(dòng)子、nisR、nisK和SPUsp4s/nucA/cwaM6/t1t2基因，以乳酸球菌作為宿主菌，以乳鏈菌肽作為誘導(dǎo)分子，構(gòu)建更為安全穩(wěn)定的乳酸菌食品級(jí)高效誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞分泌表達(dá)的θ型復(fù)制載體系統(tǒng)。OprF/H為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，是銅綠假單胞菌外膜蛋白組分F和H的融合蛋白，具有良好的免疫原性，為檢測該系統(tǒng)的可行性，將OprF/H基因克隆入構(gòu)建的載體中，在乳酸球菌中進(jìn)行高效誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞壁分泌表達(dá)，為利用此兩種載體表達(dá)各

4、種外源性和內(nèi)源性的功能基因提供理論和技術(shù)依據(jù)，同時(shí)也為研制有效的防治銅綠假單胞菌的新型疫苗提供思路。 從L.lactisSMQ719/pRAF800中提取到食品級(jí)載體pRAF800，根據(jù)公布的pRAF800的復(fù)制子序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增rep基因，經(jīng)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ酶切，利用T4連接酶與pMG36e的Emr連接。連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入L.lactisNZ9000中，經(jīng)Em篩選、克隆子鑒定，獲得重組質(zhì)粒pEmr∶rep。用限

5、制酶HindⅢ酶切pEmr∶rep，pEmr∶rep經(jīng)綠豆核酸酶削平，T4連接酶連接，獲得含Emr的θ復(fù)制子缺失載體pEmr∶Arep。 然后以pNZ8048DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的PnisA和TpepN序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出大小為312bp的PnisA-MCS-TpepN基因片段，再用限制酶XbaⅠ酶切pRAF800和PnisA-MCS-TpepN基因，用T4連接酶將PnisA-MCS-TpenN基因與去磷酸化的線性pRAF8

6、00進(jìn)行連接，用電轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入L.lactisNZ9000感受態(tài)細(xì)胞中，在Mel-EL1和Mel-BCP培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，根據(jù)a-aga酶特殊代謝底物-蜜二糖的食品級(jí)顯性選擇標(biāo)記篩選陽性克隆子并進(jìn)行克隆子鑒定，獲得含有a-aga和PnisA-MCS-TpepN的乳酸球菌食品級(jí)細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)載體，命名為pRNA48，其大小為4.5kb。以同樣方法在pRAF800的XhoⅠ位點(diǎn)上克隆入PnisA-MCS-TnepN獲得另一食品級(jí)

7、載體pRNB48。 以pVE5524為模板，根據(jù)已公布的SPUsp4s和t1t2的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和NheⅠ酶切，用T4連接酶與經(jīng)NcoⅠ和NheⅠ限制內(nèi)切酶酶切并去磷酸化的線性pRNA48連接，用電轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入L.lactisNZ9000感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Mel-EL1和Mel-BCP培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、篩選和克隆子鑒定，獲得含有a-aga和Pni

8、sA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2的乳酸球菌食品級(jí)高效誘導(dǎo)分泌表達(dá)載體，命名為pRNV48，其大小為6.0kb。利用nisin誘導(dǎo)L.lactisNZ9000/pRNV48分泌表達(dá)Nuc，使Nuc靶定到細(xì)胞壁上，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示表達(dá)的Nuc在1ng/mLnisin誘導(dǎo)3小時(shí)后達(dá)到峰值，經(jīng)TB-D平板檢測，表達(dá)產(chǎn)物是具有活性的Nuc。 為檢測構(gòu)建的表達(dá)載體pRNA48和pRNV48是否可以

9、高效誘導(dǎo)表達(dá)外源基因，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出OprF/H基因，并將其克隆入載體pRNA48和pRNV48中，用電轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入L.lactisNZ9000中，經(jīng)食品級(jí)選擇標(biāo)記a-aga篩選和克隆子鑒定，獲得重組載體pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin進(jìn)行重組乳酸球菌菌株的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE，Westen-blot分析，以及與相應(yīng)抗原的凝集反應(yīng)證明，表達(dá)產(chǎn)物具有活性，表達(dá)蛋白分

10、別占細(xì)胞內(nèi)可溶蛋白的9.6％和細(xì)胞壁錨定蛋白的9.8％。 主要工作包括： 1.構(gòu)建了含Emr的θ復(fù)制子缺失載體pEmr∶△rep。 2.成功構(gòu)建了食品級(jí)載體pRNA48和pRNV48，可在乳酸球菌L.lactisNZ9000中進(jìn)行θ型復(fù)制，并與L.lactisNZ9000宿主菌共同構(gòu)成乳酸球菌NICE系統(tǒng)食品級(jí)胞內(nèi)和分泌表達(dá)系統(tǒng)。 3.構(gòu)建的系統(tǒng)在nisin的誘導(dǎo)下，在胞內(nèi)表達(dá)了OprF/H融合蛋白，表達(dá)

11、產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，分子量為55KDa，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間3h，nisin終濃度為10ng/mL時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最高值，占胞內(nèi)可溶蛋白的9.6％。經(jīng)Westen-blot檢測為活性蛋白。 4.構(gòu)建的系統(tǒng)在nisin的誘導(dǎo)下，成功地將OprF/H融合蛋白錨定在細(xì)胞壁上，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，分子量為58KDa，最高產(chǎn)量占細(xì)胞壁錨定蛋白的9.8％。經(jīng)Westen-blot檢測為活性蛋白。 本研究構(gòu)建的食品級(jí)載體可作為