CBMs功能架構分析及糖苷水解酶TrCel12A熱穩(wěn)定性機理研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、纖維素類生物質的高效轉化利用是解決資源錯置、環(huán)境污染與能源缺乏的重大課題,具有重要的現(xiàn)實意義。大部分天然纖維素降解酶都具有催化模塊(CDs)、碳水化合物結合模塊(CBMs)。CBMs具有識別和結合底物的功能,輔助CDs對底物的催化水解。設計獲得高效纖維素降解酶有兩大策略,第一提高纖維素酶蛋白對纖維素類底物的結合力,可以通過增加CBMs模塊的數(shù)量和提高CBMs和CDs對底物的結合力來實現(xiàn);其次,設計提高酶蛋白整體結構的熱穩(wěn)定性。生物煉制產

2、業(yè)采用高溫生產環(huán)境,能夠加快反應速度并減少雜菌污染,因此需要高熱穩(wěn)定性的酶蛋白提高降解效率并降低生產成本。
  GH12家族的TrCel12A是只有一個CD模塊的嗜中溫內切纖維素酶,只有234個氨基酸,結構簡單,具有很大的改造空間。鑒于定向篩選的不確定性以及長時耗,本文綜合生物信息學分析手段與分子動力學模擬研究策略,對不同結合模式的CBMs家族進行了功能架構分析,來篩選適合與TrCel12A重組的CBMs模塊;運用分子動力學模擬探

3、宄該酶的熱穩(wěn)定性機制,定位潛在的突變靶點,并設計了四個突變期望提高該糖菅水解酶的熱穩(wěn)定性。計算方法和實驗方法的結合大大減少了實驗測定的工作量。本文主要內容及研究結果如下:
  (1) CBMs能夠自主折疊并發(fā)揮功能,在CAZy數(shù)據(jù)庫中,序列相似度30%以上的CBMs被歸于同一CBMs家族,具有相似的結構特征。對三種不同結合模式的7個CBMs家族進行功能架構分析,對研究CBMs的功能混雜性和理性設計提高CBMs結合力都具有重要理論價

4、值。本文研究發(fā)現(xiàn),CBMs功能架構處偏好芳香族氨基酸(W、Y)和極性氨基酸(Q、R、N),結合模式不同的CBMs對酸堿氨基酸的偏好不同,這是CBMs識別底物的分子基礎;不同家族在功能架構處采用增加亞位點數(shù)量或增加亞位點上的氨基酸數(shù)量來保障對底物的結合能力;功能架構序列譜表明不同CBMs家族具有不同數(shù)量的底物結合亞位點,而且與CDs相比,保守氨基酸數(shù)量相對較少,通常為芳香族氨基酸(W、Y)和弱極性氨基酸(N、Q),大部分分布在A型CBMs

5、中;不同CBMs家族功能架構上的絕對保守氨基酸、相對保守氨基酸和可變氨基酸識別碳水化合物底物糖環(huán)上各羥基氧原子的模式各不相同,從而不同CBMs家族可對結構相近的碳水化合物底物進行部分識別,這可能是不同CBMs家族產生功能混雜性的分子基礎。
  (2)應用分子動力學模擬分析TrCel1A的熱穩(wěn)定性的影響因素。本文使用Gromacs軟件模擬溶劑環(huán)境,并設置了四個溫度梯度(300K、350K、400K、500K)對TrCel1A進行分子

6、動力學模擬。分析RMSF值發(fā)現(xiàn)蛋白的柔性分布是不均勻的,蛋白的N末端和活性中心是高柔性位點;四個位于不同二級結構上的N末端突變的分子動力學模擬結果表明,引入大的疏水基團(G41F)以及引入帶電基團(Q6K)等方式能夠增強N末端內部的相互作用,從而提高酶蛋白整體的結構穩(wěn)定性;S25P通過引入內酰胺環(huán)的方式降低了α-螺旋的柔性,但是降低單個二級結構的柔性沒有提高整體蛋白的熱穩(wěn)定性。
  (3)N末端突變對TrCel1A熱穩(wěn)定性的影響的

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