12724.理性設(shè)計改造熒光素酶的熱穩(wěn)定性

1、理性理性設(shè)計改造設(shè)計改造熒光素酶熒光素酶的熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性EngineeringThermostabilityofLuciferasebyRationalDesign學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：于浩然指導(dǎo)教師：黃鶴副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一四年六月摘要與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比，生物酶因具有特殊的優(yōu)勢，正在漸漸成為工業(yè)領(lǐng)域的主要工具。然而在工業(yè)生產(chǎn)苛刻的環(huán)境下，大部分生物酶不能夠保持很高的活性。因此為了提高生物酶的工業(yè)價值，有必要通過蛋白質(zhì)

2、工程技術(shù)對其進(jìn)行改造以提高熱穩(wěn)定性。北美螢火蟲（Photinuspyralis）熒光素酶是一種高效催化生物發(fā)光反應(yīng)的蛋白酶，具有極高的應(yīng)用價值。然而野生型熒光素酶的熱穩(wěn)定性很差，37oC下，半衰期僅為23分鐘，這在很大程度上限制了它在工業(yè)中的應(yīng)用。本研究以北美螢火蟲熒光素酶作為研究對象，嘗試?yán)靡环N新的理性設(shè)計方法RFSP（rigidifyflexiblesitesthroughprolinesubstitutions）提高其熱穩(wěn)定性。

3、首先利用分子動力學(xué)模擬軟件Gromacsv4.5.5，幾何模擬軟件FRODA以及獲取BFact值的BFITTER軟件預(yù)測了熒光素酶結(jié)構(gòu)內(nèi)柔性區(qū)域Fragment471481，F(xiàn)ragment487495。然后結(jié)合β轉(zhuǎn)角序列統(tǒng)計學(xué)信息以及引入位置原有的殘基不參與形成氫鍵的原則確定了兩個突變位點D476P和H489P，同時選取存在于非柔性區(qū)域的突變位點S307P作為對照。我們在大腸桿菌BL21（DE3）內(nèi)成功構(gòu)建了野生型熒光素酶重組載體（p

4、ET28aluc），利用QuikChange定點突變方法引入三個突變位點，低溫下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳離子親和層析的手段純化得到野生型及突變型熒光素酶。在對野生型及突變型熒光素酶的熱穩(wěn)定性，生物發(fā)光光譜，動力學(xué)常數(shù)測定后發(fā)現(xiàn)，H489P突變型的熱穩(wěn)定性提高了約1.5倍，同時活性以及生物發(fā)光光譜沒有受到任何影響。本研究首次提出了能有效提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的剛化柔性位點（rigidifyflexiblesites，RFS）的策略并將其成功應(yīng)用于