通過(guò)基因定點(diǎn)突變提高甲基對(duì)硫磷水解酶MPH的熱穩(wěn)定性.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥在廣泛應(yīng)用的同時(shí)也給環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重的污染,甚至威脅到人類(lèi)的健康。早在上世紀(jì)六七十年代,就有人發(fā)現(xiàn)在自然環(huán)境中微生物可以分泌有機(jī)磷降解酶來(lái)降解有機(jī)磷農(nóng)藥,它可以破壞有機(jī)磷分子的磷酸酯鍵,最終使有機(jī)磷化合物毒性消失,這一發(fā)現(xiàn)為消除有機(jī)磷農(nóng)藥造成的污染提供了更好的途徑。
　　本文研究的對(duì)象是一個(gè)來(lái)源于蒼白桿菌(Ochrobactrum sp. M231)的甲基對(duì)硫磷水解酶MPH。MPH具有高效的降解甲基對(duì)硫磷的水解活性,但是其

2、熱穩(wěn)定性卻很差。同時(shí),另一個(gè)來(lái)源于假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1)的甲基對(duì)硫磷水解酶OPHC2,和MPH具有相同的水解活性,但是熱穩(wěn)定性卻比MPH好。為了提高甲基對(duì)硫磷水解酶MPH的熱穩(wěn)定性,將其和OPHC2進(jìn)行比對(duì)分析,兩者蛋白質(zhì)序列的一致度和相似度分別為48％和66%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果,選擇了位于蛋白質(zhì)相似度低的一段區(qū)域,通過(guò)單點(diǎn)突變和組合突變對(duì)其基因進(jìn)行了分子設(shè)計(jì),將突變酶在大腸桿

3、菌中進(jìn)行表達(dá)純化,然后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析以確定突變效果。
　　本研究共得到4個(gè)突變體,將突變酶和野生型酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性比較,經(jīng)分子改良后的突變酶在熱穩(wěn)定性上有著不同程度的改變。其中突變體MPHP41D_P43K的熱穩(wěn)定性較野生型有了顯著的提高,在65℃保溫10min后仍然具有70%的酶活,在65℃和70℃條件時(shí)的半衰期分別是原酶的2倍和1.5倍,其中它的比活也是原酶的1.8倍。究其原因,可能是由于將蛋白表面的第41位和第43位的脯