大腸埃希氏菌植物分離株種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　大腸桿菌常寄生在人和動(dòng)物的腸道中，在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下，也會(huì)伴隨糞便散布在周?chē)h(huán)境中。2006年9月美國(guó)“毒菠菜”事件和2011年5月德國(guó)腸出血性大腸桿菌O104:H4等一系列食用蔬菜所致疫情的暴發(fā)表明，植物很有可能攜帶致病性大腸桿菌，并成為繼人和動(dòng)物腸道后大腸桿菌的另一重要宿主。沙拉、大拌菜等生吃蔬菜的方式很流行，是民眾公認(rèn)的營(yíng)養(yǎng)健康餐。然而，如果人食用了被致病性大腸桿菌污染的蔬菜之后，健康將受到嚴(yán)重威脅

2、。目前，關(guān)于大腸桿菌植物分離株的研究還比較匱乏，對(duì)于其在植物體內(nèi)持續(xù)生存的機(jī)制尚不清楚。全基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，為大腸桿菌種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究提供了空前機(jī)遇。
　　本課題中，我們收集了上百株分離自植物內(nèi)部的大腸桿菌分離株，以分離自人和動(dòng)物的ECOR菌株為參照，對(duì)上述菌株進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)全基因組序列進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳學(xué)分析，以期：①重建大腸桿菌植物分離株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；②從遺傳多樣性和基因組成角度，比較大腸桿菌植物

3、分離株和人/動(dòng)物分離株ECOR的差異；③探討大腸桿菌在植物體內(nèi)生存的遺傳機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容與結(jié)果：
　　全基因組SNP變異及種群多樣性分析
　　本研究中，我們對(duì)105株大腸桿菌植物分離株（GMB）和66株人/動(dòng)物分離株（ECOR）進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，并收集下載了64株NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的大腸桿菌完成圖序列。對(duì)共計(jì)256株菌進(jìn)行全基因組范圍SNP鑒定。經(jīng)組裝序列和測(cè)序reads雙重校驗(yàn)，共得到354,888個(gè)可靠

4、的SNP變異位點(diǎn)?；赟NP的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，GMB菌株幾乎覆蓋了所有已知的基因型分群，與過(guò)去基于MLST的分析結(jié)果基本一致。結(jié)合核苷酸多樣性π值的計(jì)算，我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌植物分離株的遺傳多樣性超過(guò)了大腸桿菌全球分離株的代表集合—ECOR。其中，GMB菌株在大腸桿菌B1群的分布最廣泛，占全部GMB菌株的39.05％(41/105)。此外，我們發(fā)現(xiàn)GMB菌株存在兩個(gè)遺傳距離特別遠(yuǎn)的特有分支。根據(jù)平均核苷酸一致性(ANI)計(jì)算結(jié)果，可將其歸

5、于類(lèi)大腸桿菌分支C-I和C-V。
　　GMB菌株采樣時(shí)間和采樣地點(diǎn)信息比較詳細(xì)，為通過(guò)時(shí)間-空間分布規(guī)律研究大腸桿菌在自然環(huán)境中持續(xù)生存和傳播的模式提供了有力的背景資料。通過(guò)比較不同年份每個(gè)分離地點(diǎn)GMB菌株的組成情況，發(fā)現(xiàn)即便在同一農(nóng)場(chǎng)，大腸桿菌種群組成在不同年份之間變化也很大（Fisher精確檢驗(yàn)，P=0.0362）。GMB菌株兩兩之間的遺傳距離與采樣時(shí)間、地點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析表明，同一農(nóng)場(chǎng)不同年份的GMB菌株存在異質(zhì)性，提示大腸桿

6、菌在植物中僅能當(dāng)年寄生，來(lái)年會(huì)發(fā)生種群更替現(xiàn)象；同時(shí)，來(lái)自不同農(nóng)場(chǎng)但遺傳距離相當(dāng)近的GMB樣本只有少數(shù)幾對(duì)，說(shuō)明同一年份大腸桿菌植物分離株跨地區(qū)傳播的現(xiàn)象較為少見(jiàn)。
　　ECOR與GMB的種群進(jìn)化推動(dòng)力
　　Tajima’s D中性檢驗(yàn)是推測(cè)DNA分子水平進(jìn)化歷程的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，可用于判斷隨機(jī)遺傳漂變、定向選擇、種群擴(kuò)增、瓶頸效應(yīng)、遺傳搭載等效應(yīng)。本研究利用GD軟件對(duì)66株ECOR菌株的143,865個(gè)變異位點(diǎn)和100株G

7、MB菌株（不包括類(lèi)分支C-V菌株）的185,854個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行Tajima’s D中性檢驗(yàn)。經(jīng)計(jì)算，得到ECOR和GMB種群的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)量D值分別為0.448242和-0.151549，接近0，說(shuō)明ECOR和GMB菌株在種群水平上符合“中性突變的隨機(jī)漂變理論”。
　　為探究ECOR和GMB兩個(gè)種群是否受宿主環(huán)境（動(dòng)物或植物）選擇壓力的影響，我們利用KaKs Caculator軟件的不同模型分別計(jì)算了兩個(gè)種群中各基因非同義/同義置換

8、率的比值Ka/Ks。通過(guò)繪制箱線圖，發(fā)現(xiàn)GMB和ECOR兩個(gè)種群的Ka/Ks比值分布基本一致，但同時(shí)都存在異常值。通過(guò)多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，在這些異常值中鑒定出17個(gè)具有正向選擇信號(hào)的基因。其中5個(gè)出現(xiàn)在ECOR種群中，分別是maa、csgC、hypA、hsrA和ybdJ，前3個(gè)基因與大腸桿菌在宿主腸道內(nèi)的定植密切相關(guān)，hsrA基因可能與耐藥性相關(guān)；GMB種群中存在12個(gè)受正向選擇的基因位點(diǎn)，其中bssS基因參與生物膜調(diào)控，dkgB、asr、

9、blr和yibD基因分別與滲透壓刺激、酸休克和營(yíng)養(yǎng)饑餓等應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。該結(jié)果表明雖然大腸桿菌在種群水平以中性進(jìn)化為主，但在基因水平存在正向選擇，幫助不同種群的大腸桿菌適應(yīng)各自生存環(huán)境。
　　與植物體內(nèi)生存相關(guān)的基因元件鑒定
　　基因獲得缺失是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的重要手段。GMB菌株很可能會(huì)獲得一些特有基因元件，利于其在植物體內(nèi)生存。本研究利用BLAST和SOAP aligner等生物信息學(xué)序列比對(duì)軟件，對(duì)附屬基因組在測(cè)序樣本中

10、的存在情況進(jìn)行解析，并與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌附屬基因組片段的獲得缺失情況與其所在進(jìn)化分支密切相關(guān)，但GMB整個(gè)種群不存在特異性的基因組片段。
　　由于GMB菌株在B1群中分布最廣泛，我們將研究范圍聚焦在B1群，分析了B1群41株GMB菌株和19株ECOR菌株的附屬基因組獲得缺失情況。最終，鑒定出總長(zhǎng)度為105.73 Kbp的45個(gè)大片段，在至少5株GMB菌株中存在，而在19株ECOR菌株中均缺失。對(duì)鑒定的45個(gè)大片

11、段進(jìn)行功能分類(lèi)，主要鑒定出4類(lèi)重要的功能：編碼DNA斷裂-重連蛋白和二氫葉酸還原酶，參與DNA損傷修復(fù)和維持細(xì)胞分裂時(shí)DNA含量的穩(wěn)定性；噬菌體相關(guān)蛋白，傳播毒力因子和耐藥性基因；AraC家族蛋白，降解植物細(xì)胞壁，參與細(xì)菌和植物的相互作用；編碼精氨基琥珀酸合酶，參與精氨酸的生物合成通路，在氮饑餓狀態(tài)下提供氮源。其中，AraC家族蛋白對(duì)于大腸桿菌從植物葉子表面進(jìn)入葉子內(nèi)部尋求相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境具有重要意義。此外，通過(guò)對(duì)獲得缺失熱圖的分析，

12、我們發(fā)現(xiàn)三株分屬于不同進(jìn)化分支的GMB菌株擁有大量共同的附屬基因組片段。結(jié)合時(shí)空分布分析結(jié)果和菌株背景信息，我們推測(cè)GMB菌株雖然不是前一年大腸桿菌的直系后代，但他們可通過(guò)某種途徑（如土壤或噬菌體）獲得前一年菌株的基因組殘留物。
　　研究結(jié)論與意義：
　　本研究首次從全基因組角度分析了植物體內(nèi)分離的大腸桿菌的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，為認(rèn)識(shí)大腸桿菌在植物宿主中可能的生存及傳播機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)選擇壓力分析，分別鑒定出ECOR和

13、GMB兩個(gè)種群受宿主環(huán)境選擇壓力影響的功能基因位點(diǎn)，加深了對(duì)大腸桿菌適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。通過(guò)基因獲得缺失分析，發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌在植物體內(nèi)定植和毒力獲得相關(guān)的基因片段，初步探討了大腸桿菌在植物中生存并能引起人體致病的遺傳機(jī)制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管GMB菌株難以連年在同一局部區(qū)域增殖，但可以通過(guò)土壤等途徑遺留下基因組片段，并被新的替換種群所獲取。這為致病、耐藥等基因的水平轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。因此，加強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)并切斷這一新的潛在傳