大腸埃希氏菌植物分離株種群結構和遺傳多樣性研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　大腸桿菌常寄生在人和動物的腸道中，在環(huán)境衛(wèi)生不良的情況下，也會伴隨糞便散布在周圍環(huán)境中。2006年9月美國“毒菠菜”事件和2011年5月德國腸出血性大腸桿菌O104:H4等一系列食用蔬菜所致疫情的暴發(fā)表明，植物很有可能攜帶致病性大腸桿菌，并成為繼人和動物腸道后大腸桿菌的另一重要宿主。沙拉、大拌菜等生吃蔬菜的方式很流行，是民眾公認的營養(yǎng)健康餐。然而，如果人食用了被致病性大腸桿菌污染的蔬菜之后，健康將受到嚴重威脅

2、。目前，關于大腸桿菌植物分離株的研究還比較匱乏，對于其在植物體內持續(xù)生存的機制尚不清楚。全基因組測序技術的飛速發(fā)展，為大腸桿菌種群結構和遺傳多樣性的研究提供了空前機遇。
　　本課題中，我們收集了上百株分離自植物內部的大腸桿菌分離株，以分離自人和動物的ECOR菌株為參照，對上述菌株進行高通量測序，并對全基因組序列進行種群結構和群體遺傳學分析，以期：①重建大腸桿菌植物分離株的系統(tǒng)發(fā)育關系；②從遺傳多樣性和基因組成角度，比較大腸桿菌植物

3、分離株和人/動物分離株ECOR的差異；③探討大腸桿菌在植物體內生存的遺傳機制。
　　研究內容與結果：
　　全基因組SNP變異及種群多樣性分析
　　本研究中，我們對105株大腸桿菌植物分離株（GMB）和66株人/動物分離株（ECOR）進行全基因組序列測定，并收集下載了64株NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的大腸桿菌完成圖序列。對共計256株菌進行全基因組范圍SNP鑒定。經(jīng)組裝序列和測序reads雙重校驗，共得到354,888個可靠

4、的SNP變異位點?；赟NP的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，GMB菌株幾乎覆蓋了所有已知的基因型分群，與過去基于MLST的分析結果基本一致。結合核苷酸多樣性π值的計算，我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌植物分離株的遺傳多樣性超過了大腸桿菌全球分離株的代表集合—ECOR。其中，GMB菌株在大腸桿菌B1群的分布最廣泛，占全部GMB菌株的39.05％(41/105)。此外，我們發(fā)現(xiàn)GMB菌株存在兩個遺傳距離特別遠的特有分支。根據(jù)平均核苷酸一致性(ANI)計算結果，可將其歸

5、于類大腸桿菌分支C-I和C-V。
　　GMB菌株采樣時間和采樣地點信息比較詳細，為通過時間-空間分布規(guī)律研究大腸桿菌在自然環(huán)境中持續(xù)生存和傳播的模式提供了有力的背景資料。通過比較不同年份每個分離地點GMB菌株的組成情況，發(fā)現(xiàn)即便在同一農(nóng)場，大腸桿菌種群組成在不同年份之間變化也很大（Fisher精確檢驗，P=0.0362）。GMB菌株兩兩之間的遺傳距離與采樣時間、地點的關聯(lián)分析表明，同一農(nóng)場不同年份的GMB菌株存在異質性，提示大腸桿

6、菌在植物中僅能當年寄生，來年會發(fā)生種群更替現(xiàn)象；同時，來自不同農(nóng)場但遺傳距離相當近的GMB樣本只有少數(shù)幾對，說明同一年份大腸桿菌植物分離株跨地區(qū)傳播的現(xiàn)象較為少見。
　　ECOR與GMB的種群進化推動力
　　Tajima’s D中性檢驗是推測DNA分子水平進化歷程的一種統(tǒng)計學方法，可用于判斷隨機遺傳漂變、定向選擇、種群擴增、瓶頸效應、遺傳搭載等效應。本研究利用GD軟件對66株ECOR菌株的143,865個變異位點和100株G

7、MB菌株（不包括類分支C-V菌株）的185,854個變異位點進行Tajima’s D中性檢驗。經(jīng)計算，得到ECOR和GMB種群的統(tǒng)計檢驗量D值分別為0.448242和-0.151549，接近0，說明ECOR和GMB菌株在種群水平上符合“中性突變的隨機漂變理論”。
　　為探究ECOR和GMB兩個種群是否受宿主環(huán)境（動物或植物）選擇壓力的影響，我們利用KaKs Caculator軟件的不同模型分別計算了兩個種群中各基因非同義/同義置換

8、率的比值Ka/Ks。通過繪制箱線圖，發(fā)現(xiàn)GMB和ECOR兩個種群的Ka/Ks比值分布基本一致，但同時都存在異常值。通過多種統(tǒng)計學方法，在這些異常值中鑒定出17個具有正向選擇信號的基因。其中5個出現(xiàn)在ECOR種群中，分別是maa、csgC、hypA、hsrA和ybdJ，前3個基因與大腸桿菌在宿主腸道內的定植密切相關，hsrA基因可能與耐藥性相關；GMB種群中存在12個受正向選擇的基因位點，其中bssS基因參與生物膜調控，dkgB、asr、

9、blr和yibD基因分別與滲透壓刺激、酸休克和營養(yǎng)饑餓等應激反應密切相關。該結果表明雖然大腸桿菌在種群水平以中性進化為主，但在基因水平存在正向選擇，幫助不同種群的大腸桿菌適應各自生存環(huán)境。
　　與植物體內生存相關的基因元件鑒定
　　基因獲得缺失是細菌適應環(huán)境的重要手段。GMB菌株很可能會獲得一些特有基因元件，利于其在植物體內生存。本研究利用BLAST和SOAP aligner等生物信息學序列比對軟件，對附屬基因組在測序樣本中

10、的存在情況進行解析，并與系統(tǒng)發(fā)育分析結果相關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌附屬基因組片段的獲得缺失情況與其所在進化分支密切相關，但GMB整個種群不存在特異性的基因組片段。
　　由于GMB菌株在B1群中分布最廣泛，我們將研究范圍聚焦在B1群，分析了B1群41株GMB菌株和19株ECOR菌株的附屬基因組獲得缺失情況。最終，鑒定出總長度為105.73 Kbp的45個大片段，在至少5株GMB菌株中存在，而在19株ECOR菌株中均缺失。對鑒定的45個大片

11、段進行功能分類，主要鑒定出4類重要的功能：編碼DNA斷裂-重連蛋白和二氫葉酸還原酶，參與DNA損傷修復和維持細胞分裂時DNA含量的穩(wěn)定性；噬菌體相關蛋白，傳播毒力因子和耐藥性基因；AraC家族蛋白，降解植物細胞壁，參與細菌和植物的相互作用；編碼精氨基琥珀酸合酶，參與精氨酸的生物合成通路，在氮饑餓狀態(tài)下提供氮源。其中，AraC家族蛋白對于大腸桿菌從植物葉子表面進入葉子內部尋求相對穩(wěn)定的生存環(huán)境具有重要意義。此外，通過對獲得缺失熱圖的分析，

12、我們發(fā)現(xiàn)三株分屬于不同進化分支的GMB菌株擁有大量共同的附屬基因組片段。結合時空分布分析結果和菌株背景信息，我們推測GMB菌株雖然不是前一年大腸桿菌的直系后代，但他們可通過某種途徑（如土壤或噬菌體）獲得前一年菌株的基因組殘留物。
　　研究結論與意義：
　　本研究首次從全基因組角度分析了植物體內分離的大腸桿菌的種群結構和遺傳多樣性，為認識大腸桿菌在植物宿主中可能的生存及傳播機制奠定了基礎。通過選擇壓力分析，分別鑒定出ECOR和

13、GMB兩個種群受宿主環(huán)境選擇壓力影響的功能基因位點，加深了對大腸桿菌適應性進化機制的認識。通過基因獲得缺失分析，發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌在植物體內定植和毒力獲得相關的基因片段，初步探討了大腸桿菌在植物中生存并能引起人體致病的遺傳機制。同時發(fā)現(xiàn)，盡管GMB菌株難以連年在同一局部區(qū)域增殖，但可以通過土壤等途徑遺留下基因組片段，并被新的替換種群所獲取。這為致病、耐藥等基因的水平轉移創(chuàng)造了條件。因此，加強農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤環(huán)境監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)并切斷這一新的潛在傳