生物反應(yīng)器內(nèi)應(yīng)用富血小板血漿構(gòu)建組織工程骨體內(nèi)血管化的評估的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　 股骨頭缺血性壞死是骨科常見疾患，股骨頭壞死是由于股骨頭內(nèi)壓力增高，股骨頭骨組織不能得到營養(yǎng)血管的正常供血，使股骨頭組織中的骨細(xì)胞、骨髓、造血細(xì)胞、其他細(xì)胞發(fā)生壞死。治療股骨頭壞死是當(dāng)今世界的一大難題，股骨頭壞死的主要原因是由于股骨頭的血運(yùn)被破壞，從而引起了骨細(xì)胞及骨髓成分死亡及隨后的修復(fù)，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變、股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙的疾病。本實(shí)驗(yàn)主要是應(yīng)用組織工程技術(shù)，構(gòu)建組織工程化骨來評估體內(nèi)血管化的過程，進(jìn)而

2、為重建股骨頭的血運(yùn)提供一種可行性方案。本實(shí)驗(yàn)取新西蘭大白兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用富血小板血漿(PRP)進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后與生物相容性好的支架材料β-TCP結(jié)合進(jìn)行培養(yǎng)，由于β-TCP三維空間具有更多的延伸方向，有助于控制干細(xì)胞生長行為，提高單位擴(kuò)增速率，適于在微重力體系中模擬體內(nèi)組織細(xì)胞的生長微環(huán)境，適應(yīng)剪切力，促進(jìn)骨分化。另一方面，β-TCP本身可以作為一種很好的存貯和控釋給藥系統(tǒng)，在培養(yǎng)過程中逐步釋放骨誘導(dǎo)生長因子。最后將復(fù)合體放

3、入生物反應(yīng)器中進(jìn)行三維培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程化骨，將構(gòu)建的組織工程化骨植入動(dòng)物體內(nèi)，3月后處死動(dòng)物，取材，標(biāo)本觀察，PCR及ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來觀察血管特異性標(biāo)志物，從而用來評價(jià)該種構(gòu)建組織工程化骨對于血管化的影響，從而為重建股骨頭血運(yùn)提供一種可行性方案。
　　 材料和方法
　　 1取2-3月齡的健康的新西蘭大白兔，麻醉好后放于實(shí)驗(yàn)臺，備皮，固定，消毒，鋪無菌巾，在無菌條件下用穿刺針抽取雙側(cè)脛骨平臺內(nèi)下側(cè)骨髓5ml，梯度密

4、度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法提取BMSCs，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定。
　　 2經(jīng)兔耳緣靜脈抽取新鮮血液約10ml，在無菌條件下，迅速加入到盛有1ml5％枸櫞酸鈉的15ml離心管中，輕輕搖晃，防止凝固。
　　 3制備富血小板血漿(PRP)，將上述離心管中的血液放入離心機(jī)中，采用二次離心法制備富血小板血漿，第一次離心3300轉(zhuǎn)/分，第二次離心3000轉(zhuǎn)/分，然后得到無色透明的膠凍狀物質(zhì)即是富血小板血漿。
　　

5、 4將制備的富血小板血漿加入到培養(yǎng)基中，3天換液一次，培養(yǎng)BMSCs。
　　 5將用富血小板血漿培養(yǎng)的BMSCs制成約1ml的細(xì)胞懸液，滴加到β-磷酸三鈣(β-TCP)上，構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體，然后放入生物反應(yīng)器中用含有富血小板血漿的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周。
　　 6將在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的復(fù)合體取出，植入到新西蘭大白兔的皮下，縫合，三個(gè)月以后，取出復(fù)合體材料，然后免疫組化檢測血管標(biāo)志物CD31，.第Ⅷ因子關(guān)連抗原(VWF)的表達(dá)

6、。
　　 結(jié)果
　　 1.對于細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化，可以采用倒置相差顯微鏡來觀察，1-3日后在顯微鏡下可以觀察到有少量的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁，形狀呈不規(guī)則的短梭形。數(shù)日之后培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細(xì)胞集落群，7-8天后，這種細(xì)胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可基本鋪滿瓶底。鋪滿瓶底后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，貼壁較原代細(xì)胞快，細(xì)胞核較大，胞漿內(nèi)顆粒較原代細(xì)胞多。加入富血小板血漿(PRP)后，細(xì)胞的生長速度較以前明顯加快，細(xì)胞排列規(guī)

7、整，呈明顯的漩渦狀生長。
　　 2.β-磷酸三鈣(β-TCP)上電鏡掃描可見有細(xì)胞粘附，細(xì)胞伸出偽足和β-磷酸三鈣(β-TCP)相連接，細(xì)胞在β-TCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。
　　 3.實(shí)驗(yàn)組免疫組化結(jié)果顯示血管標(biāo)志物CD31，第Ⅷ因子關(guān)連抗原(VWF)呈強(qiáng)陽性表現(xiàn)。
　　 4.富血小板血漿富含多種細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)成骨或軟骨，可以促進(jìn)血管化的過程。
　　 結(jié)論
　　 1.原代細(xì)胞

8、培養(yǎng)一天后，于倒置相差顯微鏡下觀察可見有細(xì)胞貼壁，呈小圓形。第二天可見有不規(guī)則性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞貼壁，三日后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，呈不規(guī)則的短梭狀（圖3）。一周后，細(xì)胞體積明顯增大，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細(xì)胞集落群，數(shù)日后，這種細(xì)胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可基本鋪滿瓶底，呈螺旋簇狀生長（圖4），細(xì)胞可基本長滿瓶底，生長均勻，細(xì)胞伸展充分，形態(tài)均一，并開始向多角型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，呈明顯的旋渦狀生長。
　　 2.骨髓間充質(zhì)干

9、細(xì)胞是組織工程中較理想的種子細(xì)胞。因?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞來源比較豐富，取材也方便，同時(shí)分離方法也較簡單，采用淋巴細(xì)胞分離液可以分離大量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有穩(wěn)定的體外培養(yǎng)性能，并且易于傳代。
　　 3.富血小板血漿富含多種細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)成骨或軟骨，可以促進(jìn)血管化的過程。
　　 4.β-磷酸三鈣(β-TCP)在組織工程支架材料的選擇方面具有較多的優(yōu)勢，由于其較好的組織相容性和三維立體結(jié)構(gòu)，所以，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞適合于在