2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的
   股骨頭缺血性壞死是骨科常見疾患,股骨頭壞死是由于股骨頭內(nèi)壓力增高,股骨頭骨組織不能得到營養(yǎng)血管的正常供血,使股骨頭組織中的骨細胞、骨髓、造血細胞、其他細胞發(fā)生壞死。治療股骨頭壞死是當今世界的一大難題,股骨頭壞死的主要原因是由于股骨頭的血運被破壞,從而引起了骨細胞及骨髓成分死亡及隨后的修復,繼而導致股骨頭結構改變、股骨頭塌陷、關節(jié)功能障礙的疾病。本實驗主要是應用組織工程技術,構建組織工程化骨來評估體內(nèi)血管化的過程,進而

2、為重建股骨頭的血運提供一種可行性方案。本實驗取新西蘭大白兔的骨髓間充質(zhì)干細胞,應用富血小板血漿(PRP)進行體外培養(yǎng),然后與生物相容性好的支架材料β-TCP結合進行培養(yǎng),由于β-TCP三維空間具有更多的延伸方向,有助于控制干細胞生長行為,提高單位擴增速率,適于在微重力體系中模擬體內(nèi)組織細胞的生長微環(huán)境,適應剪切力,促進骨分化。另一方面,β-TCP本身可以作為一種很好的存貯和控釋給藥系統(tǒng),在培養(yǎng)過程中逐步釋放骨誘導生長因子。最后將復合體放

3、入生物反應器中進行三維培養(yǎng),構建組織工程化骨,將構建的組織工程化骨植入動物體內(nèi),3月后處死動物,取材,標本觀察,PCR及ELISA等實驗技術來觀察血管特異性標志物,從而用來評價該種構建組織工程化骨對于血管化的影響,從而為重建股骨頭血運提供一種可行性方案。
   材料和方法
   1取2-3月齡的健康的新西蘭大白兔,麻醉好后放于實驗臺,備皮,固定,消毒,鋪無菌巾,在無菌條件下用穿刺針抽取雙側脛骨平臺內(nèi)下側骨髓5ml,梯度密

4、度離心法結合貼壁培養(yǎng)法提取BMSCs,進行原代、傳代細胞培養(yǎng)。流式細胞儀鑒定。
   2經(jīng)兔耳緣靜脈抽取新鮮血液約10ml,在無菌條件下,迅速加入到盛有1ml5%枸櫞酸鈉的15ml離心管中,輕輕搖晃,防止凝固。
   3制備富血小板血漿(PRP),將上述離心管中的血液放入離心機中,采用二次離心法制備富血小板血漿,第一次離心3300轉/分,第二次離心3000轉/分,然后得到無色透明的膠凍狀物質(zhì)即是富血小板血漿。
  

5、 4將制備的富血小板血漿加入到培養(yǎng)基中,3天換液一次,培養(yǎng)BMSCs。
   5將用富血小板血漿培養(yǎng)的BMSCs制成約1ml的細胞懸液,滴加到β-磷酸三鈣(β-TCP)上,構建細胞支架復合體,然后放入生物反應器中用含有富血小板血漿的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周。
   6將在生物反應器中培養(yǎng)的復合體取出,植入到新西蘭大白兔的皮下,縫合,三個月以后,取出復合體材料,然后免疫組化檢測血管標志物CD31,.第Ⅷ因子關連抗原(VWF)的表達

6、。
   結果
   1.對于細胞形態(tài)學上的變化,可以采用倒置相差顯微鏡來觀察,1-3日后在顯微鏡下可以觀察到有少量的兔骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁,形狀呈不規(guī)則的短梭形。數(shù)日之后培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細胞集落群,7-8天后,這種細胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后,骨髓間充質(zhì)干細胞可基本鋪滿瓶底。鋪滿瓶底后,進行細胞傳代,貼壁較原代細胞快,細胞核較大,胞漿內(nèi)顆粒較原代細胞多。加入富血小板血漿(PRP)后,細胞的生長速度較以前明顯加快,細胞排列規(guī)

7、整,呈明顯的漩渦狀生長。
   2.β-磷酸三鈣(β-TCP)上電鏡掃描可見有細胞粘附,細胞伸出偽足和β-磷酸三鈣(β-TCP)相連接,細胞在β-TCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。
   3.實驗組免疫組化結果顯示血管標志物CD31,第Ⅷ因子關連抗原(VWF)呈強陽性表現(xiàn)。
   4.富血小板血漿富含多種細胞因子,可以誘導成骨或軟骨,可以促進血管化的過程。
   結論
   1.原代細胞

8、培養(yǎng)一天后,于倒置相差顯微鏡下觀察可見有細胞貼壁,呈小圓形。第二天可見有不規(guī)則性的骨髓間充質(zhì)干細胞細胞貼壁,三日后,細胞的形態(tài)發(fā)生變化,呈不規(guī)則的短梭狀(圖3)。一周后,細胞體積明顯增大,培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細胞集落群,數(shù)日后,這種細胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后,骨髓間充質(zhì)干細胞可基本鋪滿瓶底,呈螺旋簇狀生長(圖4),細胞可基本長滿瓶底,生長均勻,細胞伸展充分,形態(tài)均一,并開始向多角型細胞轉化,呈明顯的旋渦狀生長。
   2.骨髓間充質(zhì)干

9、細胞是組織工程中較理想的種子細胞。因為骨髓間充質(zhì)干細胞來源比較豐富,取材也方便,同時分離方法也較簡單,采用淋巴細胞分離液可以分離大量的骨髓間充質(zhì)干細胞,具有穩(wěn)定的體外培養(yǎng)性能,并且易于傳代。
   3.富血小板血漿富含多種細胞因子,可以誘導成骨或軟骨,可以促進血管化的過程。
   4.β-磷酸三鈣(β-TCP)在組織工程支架材料的選擇方面具有較多的優(yōu)勢,由于其較好的組織相容性和三維立體結構,所以,骨髓間充質(zhì)干細胞適合于在

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