防治金龜子轉(zhuǎn)cry8Ea1、cry8Ga1基因草坪草的研究.pdf

1、本研究從構(gòu)建禾本科植物高效表達(dá)載體入手，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將cry8Eal，cry8Gal基因分別導(dǎo)入草坪草匍匐剪股穎中，成功獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲匍匐剪股穎植株。 本研究首先利用PCR方法從水稻中克隆了單子葉植物過氧化氫酶CatB基因的啟動(dòng)子(-329到+298)，與GenBank中公布的序列完全一致。然后構(gòu)建了四個(gè)植物表達(dá)載體p3300-Ubi-8G(組成型表達(dá)啟動(dòng)子Ubiquitin：cry8Gal基因)、p3300-CatB-8

2、G-(根部強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子CatB：cry8Gal基因)、p3300-Ubi-8E(組成型表達(dá)啟動(dòng)子Ubiquitin：cry8Eal基因)和p3300-CatB-8E(根部強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子CatB：cry8Eal基因)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到匍匐剪股穎中，經(jīng)草丁膦篩選得到抗性植株。 在得到抗性植株的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了分子檢測(cè)。利用cry8Eal、cry8Gal基因檢測(cè)引物分別進(jìn)行PCR檢測(cè)，共得到轉(zhuǎn)p3300-Ubi-8G質(zhì)粒陽性植株19

3、株，轉(zhuǎn)p3300-CatB-8G質(zhì)粒陽性植株22株，轉(zhuǎn)p3300-Ubi-8E質(zhì)粒陽性植株22株，轉(zhuǎn)p3300-CatB-8E質(zhì)粒陽性植株28株。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與cry8類基因吻合，初步證明cry8Eal、cry8Gal基因己整合到匍匐剪股穎基岡組中，Southern雜交正在進(jìn)行。對(duì)于PCR陽性植株轉(zhuǎn)錄水平的分析表明，cry8Eal、cry8Gal基因在部分轉(zhuǎn)基因株系中可以正常轉(zhuǎn)錄。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，不同株系間的表達(dá)量有明

4、顯差異，而且由水稻CatB啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因在根中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在葉子中的表達(dá)量，后者只有微弱的表達(dá)。通過ELISA的檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)基因植株能表達(dá)蛋白Cry8Eal，由CatB啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cry8Eal蛋白占根中可溶性蛋白的百分比最高可達(dá)5.37％。在初步的生物活性測(cè)定中，轉(zhuǎn)cry8Eal基因植株與未轉(zhuǎn)化植株相比接種暗黑鰓金龜幼蟲30天后，大部分植株都可以正常生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)出良好的抗蠐螬的效果。 本項(xiàng)研究為抗蟲草坪草新品種的大