人工改造的cry1Ac、cry1Ie基因在大腸桿菌、轉(zhuǎn)基因煙草和玉米中的表達(dá).pdf

1、該研究根據(jù)植物所偏愛密碼子原則,改造蘇云金芽孢桿菌cry1Ac,cry1Ie野生型基因的編碼區(qū)序列,人工合成cry1Ac,cry1Ie基因.將這兩個(gè)基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28b中,構(gòu)建成原核表達(dá)載體pETAc和pETIe.將兩個(gè)原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá).誘導(dǎo)表達(dá)出兩個(gè)目的蛋白并進(jìn)行了純化.純化的目的蛋白免疫兔子,制備了這兩種蛋白的多克隆抗體.純化這兩種蛋白的包涵體,用玉米螟進(jìn)行蟲試.蟲試結(jié)果顯

2、示原核表達(dá)的兩種包涵體蛋白對玉米螟有較好的殺蟲活性.進(jìn)一步將cry1Ac,cry1Ie基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體p3301中,構(gòu)建植物表達(dá)載體p3301ubiAc和p3301ubiIe.在這兩個(gè)表達(dá)載體中,兩個(gè)基因分別受ubiquitin啟動(dòng)子的調(diào)控.兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化煙草并得到了轉(zhuǎn)基因煙草,PCR、Southern雜交結(jié)果顯示,cry1Ac,cry1Ie基因整合到轉(zhuǎn)基因煙草的基因組中.用轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行蟲試,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草能有效殺死玉米螟

3、幼蟲.運(yùn)用PCR技術(shù)克隆了馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因Ⅱ的信號(hào)肽序列,并將其分別連到cry1Ac,gfp基因的5'端,構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體p3301ubisigAc和p3301ubisigGFP.分別用這兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化煙草,并得到轉(zhuǎn)基因植株.熒光顯微觀察到GFP在植物細(xì)胞間隙高效表達(dá),Western blot結(jié)果顯示Cry1Ac蛋白也在植物細(xì)胞間隙表達(dá).這些結(jié)果表明,馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因Ⅱ的信號(hào)肽序列能將外源蛋白定位到植物細(xì)胞間隙.ELISA結(jié)果

4、顯示,馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因Ⅱ的信號(hào)肽序列使cry1Ac基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量顯著提高.通過PCR方法,克隆了玉米葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的啟動(dòng)子(cab啟動(dòng)子)和玉米伸展蛋白基因的啟動(dòng)子(silk啟動(dòng)子).將此兩個(gè)啟動(dòng)子、玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子與cry1Ie,cry1Ac基因分別構(gòu)建成表達(dá)載體p3301cabIeubiAc,p3301silkIe和p3301ubiAc.轉(zhuǎn)化玉米得到轉(zhuǎn)基因玉米植株.轉(zhuǎn)基因玉米田間和溫室玉米螟接