人工改造的cry1Ac、cry1Ie基因在大腸桿菌、轉基因煙草和玉米中的表達.pdf

1、該研究根據(jù)植物所偏愛密碼子原則,改造蘇云金芽孢桿菌cry1Ac,cry1Ie野生型基因的編碼區(qū)序列,人工合成cry1Ac,cry1Ie基因.將這兩個基因構建到原核表達載體pET28b中,構建成原核表達載體pETAc和pETIe.將兩個原核表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,并進行了誘導表達.誘導表達出兩個目的蛋白并進行了純化.純化的目的蛋白免疫兔子,制備了這兩種蛋白的多克隆抗體.純化這兩種蛋白的包涵體,用玉米螟進行蟲試.蟲試結果顯

2、示原核表達的兩種包涵體蛋白對玉米螟有較好的殺蟲活性.進一步將cry1Ac,cry1Ie基因構建到真核表達載體p3301中,構建植物表達載體p3301ubiAc和p3301ubiIe.在這兩個表達載體中,兩個基因分別受ubiquitin啟動子的調控.兩個載體轉化煙草并得到了轉基因煙草,PCR、Southern雜交結果顯示,cry1Ac,cry1Ie基因整合到轉基因煙草的基因組中.用轉基因煙草葉片進行蟲試,結果顯示轉基因煙草能有效殺死玉米螟

3、幼蟲.運用PCR技術克隆了馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因Ⅱ的信號肽序列,并將其分別連到cry1Ac,gfp基因的5'端,構建植物轉化載體p3301ubisigAc和p3301ubisigGFP.分別用這兩個載體轉化煙草,并得到轉基因植株.熒光顯微觀察到GFP在植物細胞間隙高效表達,Western blot結果顯示Cry1Ac蛋白也在植物細胞間隙表達.這些結果表明,馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因Ⅱ的信號肽序列能將外源蛋白定位到植物細胞間隙.ELISA結果

4、顯示,馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因Ⅱ的信號肽序列使cry1Ac基因在轉基因煙草中的表達量顯著提高.通過PCR方法,克隆了玉米葉綠素a/b結合蛋白基因的啟動子(cab啟動子)和玉米伸展蛋白基因的啟動子(silk啟動子).將此兩個啟動子、玉米ubiquitin啟動子與cry1Ie,cry1Ac基因分別構建成表達載體p3301cabIeubiAc,p3301silkIe和p3301ubiAc.轉化玉米得到轉基因玉米植株.轉基因玉米田間和溫室玉米螟接