轉(zhuǎn)cry8Ca基因煙草抗蠐螬活性的評價.pdf

1、金龜子幼蟲（蠐螬）是一類世界性的重要地下害蟲，由于這類害蟲為害植物地下部分，具有一定的隱蔽性，而且分布廣泛，為害植物種類多，對農(nóng)林生產(chǎn)造成了極為嚴重的損失。蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）HBF-1菌株含有cry8Ca基因，產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白對麗金龜科的黃褐麗金龜(Anomola exoleta)和銅綠麗金龜（A.Corpulenta）具有很高的殺蟲活性，目前已經(jīng)將cry8Ca基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草

2、植株。本項研究采用RNA斑點分析和酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測定法檢測了cry8Ca基因在T1代轉(zhuǎn)基因煙草中的表達，并采用生物學方法評價了T1代轉(zhuǎn)基因煙草抗蠐螬的活性，建立了cry8Ca基因在煙草中表達的檢測方法及抗蠐螬活性的生物測定體系，為今后研究評價抗蠐螬轉(zhuǎn)基因植物提供了依據(jù)。
　　 本項研究對供試的110株T1代轉(zhuǎn)cry8Ca基因煙草進行DNA-PCR檢測,31株轉(zhuǎn)pSmCN載體的煙草植株為陽性。采用隨機引物法，通過地

3、高辛標記目的DNA片段制備探針，提取植株的RNA，進行RNA斑點雜交，結(jié)果表明外源殺蟲蛋白基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草中，并在煙草植株中遺傳表達。
　　 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測定法廣泛應用于轉(zhuǎn)基因植物表達的殺蟲蛋白的檢測。本項研究采用過碘酸鈉法，將純化的Cry8Ca殺蟲蛋白的多克隆抗體用辣根過氧化物酶標記，獲得酶標抗體結(jié)合物，經(jīng)過對各反應條件的優(yōu)化，確定了雙抗夾心ELISA方法檢測煙草中Cry8Ca殺蟲蛋白的最適體系：多克隆抗體濃

4、度為1:3200，酶標結(jié)合物濃度為1:400，pH9.6碳酸緩沖液提取，pH7.4磷酸緩沖液包被，0.5％明膠-PBST封閉，TMB底物作用15 min。采用該檢測體系檢測T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株根部Cry8Ca蛋白的表達，結(jié)果表明，Cry8C蛋白含量最高可達14.461μg/g鮮重，占總蛋白量的0.057％。在組成型表達載體（pSmCN）的煙草植株中，不同的部位蛋白表達量不同，營養(yǎng)器官的含量高于生殖器官，根部的蛋白表達量顯著高于莖基部和葉

5、部。
　　 通過室內(nèi)飼養(yǎng)研究，采用天然飼料飼喂銅綠麗和黃褐麗金龜?shù)某上x和幼蟲，明確了室內(nèi)銅綠麗金龜種群完成一個生活史平均需要272.3d，比田間種群縮短約103.8d，。黃褐麗金龜種群在室內(nèi)完成一個生活史平均需要230天。確定在壤土中接入金龜子的卵為轉(zhuǎn)基因煙草對蠐螬抗蟲性測定的最佳條件。
　　 將煙草地下根部受害程度分別設立五個危害等級，通過危害等級的評定，計算出危害指數(shù)。黃褐麗金龜和銅綠麗金龜幼蟲對供試的T1代陽性轉(zhuǎn)p