轉(zhuǎn)cry8Ca基因煙草抗蠐螬活性的評(píng)價(jià).pdf

1、金龜子幼蟲(chóng)（蠐螬）是一類(lèi)世界性的重要地下害蟲(chóng)，由于這類(lèi)害蟲(chóng)為害植物地下部分，具有一定的隱蔽性，而且分布廣泛，為害植物種類(lèi)多，對(duì)農(nóng)林生產(chǎn)造成了極為嚴(yán)重的損失。蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）HBF-1菌株含有cry8Ca基因，產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)麗金龜科的黃褐麗金龜(Anomola exoleta)和銅綠麗金龜（A.Corpulenta）具有很高的殺蟲(chóng)活性，目前已經(jīng)將cry8Ca基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因煙草

2、植株。本項(xiàng)研究采用RNA斑點(diǎn)分析和酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測(cè)定法檢測(cè)了cry8Ca基因在T1代轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)，并采用生物學(xué)方法評(píng)價(jià)了T1代轉(zhuǎn)基因煙草抗蠐螬的活性，建立了cry8Ca基因在煙草中表達(dá)的檢測(cè)方法及抗蠐螬活性的生物測(cè)定體系，為今后研究評(píng)價(jià)抗蠐螬轉(zhuǎn)基因植物提供了依據(jù)。
　　 本項(xiàng)研究對(duì)供試的110株T1代轉(zhuǎn)cry8Ca基因煙草進(jìn)行DNA-PCR檢測(cè),31株轉(zhuǎn)pSmCN載體的煙草植株為陽(yáng)性。采用隨機(jī)引物法，通過(guò)地

3、高辛標(biāo)記目的DNA片段制備探針，提取植株的RNA，進(jìn)行RNA斑點(diǎn)雜交，結(jié)果表明外源殺蟲(chóng)蛋白基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草中，并在煙草植株中遺傳表達(dá)。
　　 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測(cè)定法廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的殺蟲(chóng)蛋白的檢測(cè)。本項(xiàng)研究采用過(guò)碘酸鈉法，將純化的Cry8Ca殺蟲(chóng)蛋白的多克隆抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，獲得酶標(biāo)抗體結(jié)合物，經(jīng)過(guò)對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)煙草中Cry8Ca殺蟲(chóng)蛋白的最適體系：多克隆抗體濃

4、度為1:3200，酶標(biāo)結(jié)合物濃度為1:400，pH9.6碳酸緩沖液提取，pH7.4磷酸緩沖液包被，0.5％明膠-PBST封閉，TMB底物作用15 min。采用該檢測(cè)體系檢測(cè)T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株根部Cry8Ca蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，Cry8C蛋白含量最高可達(dá)14.461μg/g鮮重，占總蛋白量的0.057％。在組成型表達(dá)載體（pSmCN）的煙草植株中，不同的部位蛋白表達(dá)量不同，營(yíng)養(yǎng)器官的含量高于生殖器官，根部的蛋白表達(dá)量顯著高于莖基部和葉

5、部。
　　 通過(guò)室內(nèi)飼養(yǎng)研究，采用天然飼料飼喂銅綠麗和黃褐麗金龜?shù)某上x(chóng)和幼蟲(chóng)，明確了室內(nèi)銅綠麗金龜種群完成一個(gè)生活史平均需要272.3d，比田間種群縮短約103.8d，。黃褐麗金龜種群在室內(nèi)完成一個(gè)生活史平均需要230天。確定在壤土中接入金龜子的卵為轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)蠐螬抗蟲(chóng)性測(cè)定的最佳條件。
　　 將煙草地下根部受害程度分別設(shè)立五個(gè)危害等級(jí)，通過(guò)危害等級(jí)的評(píng)定，計(jì)算出危害指數(shù)。黃褐麗金龜和銅綠麗金龜幼蟲(chóng)對(duì)供試的T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)p