Bt cry8Ab1基因的克隆、表達(dá)和殺蟲活性的研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是目前研究最深入的殺蟲微生物，其殺蟲蛋白基因也是應(yīng)用最廣泛和最有發(fā)展?jié)摿Φ目瓜x基因，因此，深入發(fā)掘Bt新菌株、分離克隆新型的殺蟲基因?qū)οx的防治具有重要意義。近年來，鞘翅目害蟲尤其是金龜甲科害蟲的危害日趨嚴(yán)重，由于其幼蟲（俗稱蠐螬）生活在土壤中，給防治帶來很大的困難，本研究從本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株中篩選高毒力野生菌株，并從中分離克隆對(duì)金龜甲科害蟲有效的新型殺蟲蛋白基因，

2、研究該基因的表達(dá)和殺蟲活性，為構(gòu)建高效廣譜的Bt工程茵和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物提供新型基因資源。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1利用殺鞘翅目Bt殺蟲蛋白基因通用引物S5un8/S3un8對(duì)本室保存的66株Bt菌株進(jìn)行PCR檢測，其中菌株B-DLL和B-JJX擴(kuò)增出1.2 kb的陽性片段。生物測定結(jié)果表明，在濃度6.7μg/g時(shí)，B-DLL和B-JJX對(duì)3日齡華北大黑鰓金龜幼蟲14d的校正死亡率分別為83.4％和60.0％，對(duì)暗

3、黑鰓金龜幼蟲14d的校正死亡率分別為83.3％和76.7％;在濃度為89.8μg/mL時(shí)，B-DLL和B-JJX對(duì)柳藍(lán)葉甲3齡幼蟲96 h的校正死亡率為33.3％和46.7％。菌株B-DLL晶體近圓形，B-JJX晶體近方形;SDS-PAGE分析顯示，菌株B-DLL和B-JJX伴孢晶體主要為130 kDa的蛋白;Bt cry基因型PCR-RFLP鑒定結(jié)果表明，兩株Bt均含有新的cry8類基因。
　　 2以Bt菌株B-JJX質(zhì)粒DN

4、A為模板，根據(jù)GenBank中公布的cry8類基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物JJX5/JJX3，PCR擴(kuò)增出3.5 kb的目的片段，將其克隆到載體pBluescript SK(+)，經(jīng)測序分析表明，該基因的編碼框由3543個(gè)堿基組成，編碼的蛋白質(zhì)由1180個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白分子量133.3 kDa。該基因的核苷酸序列已經(jīng)在GenBank登錄（Accession number: EU044830），提交國際Btδ-內(nèi)毒素命名委員會(huì)并被

5、確認(rèn)為一個(gè)新的殺蟲蛋白基因，正式命名為cry8Ab1。
　　 3將cry8Ab1基因連接到Bt表達(dá)載體pSXY422b上，獲得重組質(zhì)粒pSXY-cry8Ab1，電擊轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD73-cry，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。該基因能在無晶體突變株中形成小方形晶體，SDS-PAGE檢測證實(shí)，有130 kDa的蛋白存在。cry8Ab1表達(dá)產(chǎn)物生物測定結(jié)果表明，在濃度6.7μg/g時(shí)，對(duì)3日齡華北大黑鰓金龜幼蟲14d的校正死亡率分別為5