豬肺炎支原體膜蛋白免疫親和層析及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬支原體肺炎(MycoplasmaPneumoniaeofSwine，MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起豬以咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性接觸性呼吸道傳染病。主要癥狀及表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、飼料的利用率低，病豬生長十分緩慢，甚至生長停滯。該病以發(fā)病率高，死亡率低為其特點。而在臨床上檢測感染豬，仍面臨困難。豬肺炎支原體的表面膜蛋白是該菌主要的免疫抗原，對豬肺炎支原體感染的診斷有重要意義。

2、 本研究通過制備抗豬肺炎支原體高免血清，運用辛酸.硫酸銨鹽析和陰離子交換層析技術，獲得高活性、高電泳純的IgG。再將純化IgG與CNBr-activatedSepharose4B偶聯(lián)制得抗Mhp-免疫親和層析柱，以提取和純化通過TritonX-100結合KI破碎的支原體細胞所獲得的豬肺炎支原體膜蛋白。純化的膜蛋白抗原經SDS-PAGE電泳分析，結果顯示，純化后的抗原蛋白分子的純度顯著提高，僅呈現(xiàn)66KD，48KD，46KD，40KD，3

3、2KD和24KD的6條清晰的蛋白條帶，而未純化的膜蛋白條帶有11條，分子量范圍在20KD-100KD之間。 本研究采用純化的膜蛋白抗原建立了豬肺炎支原體的間接ELISA檢測方法。試驗確定的最適ELISA工作條件為：包被純化抗原蛋白濃度5ug/ml，血清稀釋度為1:80，封閉液為1.5％BSA，封閉時間120min，抗原抗體作用時間90min，酶標二抗SPA(1:1000稀釋)作用時間為60min，陰陽性界限OD值為0.289。

4、 分別用純化抗原和粗提抗原包被ELISA板，對比二者的檢測結果發(fā)現(xiàn)，純化抗原對樣品的陽性檢出率比粗提抗原提高了7.5％。用建立的標準豬肺炎支原體ELISA檢測方法與中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的IHA試劑盒同時檢測50份血清樣品，二者總的符合率為92％。對臨床送檢的150份不同年齡段的豬血清樣品，用該ELISA方法檢測，結果顯示，斷奶前仔豬Mhp感染率為44.2％，保育豬為41.2％，育肥豬為17.9％。檢測結果說明，豬肺炎支原體在豬群