系膜細(xì)胞活化模型的建立及其對單核巨噬細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、目的:探討人腎臟系膜細(xì)胞（Human mesangial cells，HMCs）的活化最佳條件和HMCs活化的細(xì)胞表型和分子標(biāo)志，以及活化后的HMCs對人單核巨噬細(xì)胞(Human monocyte macrophages cells，HMMCs)產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法:1.人HMCs的活化研究及活化后的細(xì)胞表型和分子標(biāo)志研究:用10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml的重組人血小板源性生長因子(Recombinant

2、Human PlateletDerived Growth Factor-BB，PDGF-BB)分別刺激HMCs2h、6h、12h、24h、48h、72h，實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)技術(shù)(Real-time Quantitative PCR DetectingSystem，qPCR)尋找并確定最佳刺激濃度和時(shí)間;細(xì)胞計(jì)數(shù)(Cell Counting K-8，CCK-8)檢測HMCs活化后的增殖能力;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(Cell Scratch

3、 Test)測定HMCs活化后的趨化及遷徙能力;免疫熒光染色技術(shù)(ImmunofluorescenceStaining)檢測活化后的HMCs的Desmin、a-SMA、PDGFR-β、Transgelin、Tensin表達(dá)情況，并利用qPCR技術(shù)檢測HMCs處于活化高表達(dá)狀態(tài)下可以持續(xù)的時(shí)間。
　　2.活化的人腎系膜細(xì)胞對人單核巨噬細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng):用qPCR方法檢測PDGF-BB刺激后的HMCs是否可以分泌誘導(dǎo)HMMCs活化的細(xì)

4、胞因子以及有無分泌HMMCs活化的分子標(biāo)志;將PDGF-BB誘導(dǎo)的的HMCs與HMMCs置于Transwell系統(tǒng)中進(jìn)行共培養(yǎng)，選取2h、6h、12h、24h、48h、72h時(shí)間節(jié)點(diǎn)，研究活化后的HMCs對HMMCs的生物學(xué)效應(yīng);CCK-8檢測共培養(yǎng)后HMMCs的增殖能力，細(xì)胞劃傷實(shí)驗(yàn)檢測共培養(yǎng)后HMMCs的趨化和遷徙能力。
　　結(jié)果:1.人HMCs的活化以及活化后的細(xì)胞表型和分子標(biāo)志:(1)qPCR技術(shù)檢測不同濃度刺激下的不同時(shí)

5、間點(diǎn)的HMCs活化后的細(xì)胞因子IL-1、IL-6、CCL-2、PDGFR-β、Transgelin、TensinmRNA表達(dá)情況結(jié)果顯示:當(dāng)使用濃度為20ng/ml的PDGF-BB刺激HMCs時(shí)，效果最為明顯，且于刺激48h的時(shí)候觀察細(xì)胞因子分泌情況效果最佳并且最為顯著，72h時(shí)觀察反而有一個(gè)回落趨勢，說明HMCs活化于48h的時(shí)候出現(xiàn)頂峰。(2)不同濃度的PDGF-BB刺激HMCs后細(xì)胞的增殖能力:細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8均顯示:加入PD

6、GF-BB刺激的HMCs相比較于空白對照組，均在20ng/ml濃度的PDGF-BB刺激下增殖最為明顯(p＜0.05)。(3)活化后的HMCs的的遷徙能力變化:分別于六孔板內(nèi)劃傷20ng/ml的PDGF-BB刺激48h后的HMCs和對照組，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞最后剩余的傷痕面積明顯少于對照組，面積計(jì)算有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。(4)細(xì)胞活化表型的蛋白質(zhì)學(xué)改變:免疫熒光染色顯示，活化表型Desmin、a-SMA、PDGFR-β、Tran

7、sgelin、Tensin表達(dá)量與對照組相比均有增強(qiáng)，NF-kB的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)也明顯強(qiáng)于對照組。(5)HMCs處于活化高表達(dá)狀態(tài)下可以持續(xù)的時(shí)間:HMCs于48h的時(shí)候處于活化高表達(dá)的最高峰，以48h為基點(diǎn)，qPCR檢測技術(shù)顯示這種活化狀態(tài)一直到在此之后的48h才逐漸趨于沒有。
　　2.活化的人腎系膜細(xì)胞與人單核巨噬細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng):(1) PDGF-BB刺激HMCs細(xì)胞可以分泌促使HMMCs活化的細(xì)胞因子TNF和IL-4，而不會分泌

8、HMMCs活化的分子標(biāo)志CCL-0和CCL-15和CCL-17。(2)活化的HMCs和HMMCs共培養(yǎng):共培養(yǎng)狀態(tài)下的HMMCs不分泌CCL-17（抑炎型），而會分泌CCL-15(M1型)和CCL-1（調(diào)節(jié)型）并在24h的時(shí)候達(dá)到最高。(3)與活化的HMCs共培養(yǎng)后的HMMCs細(xì)胞的增殖能力和遷徒趨化能力都明顯高于未共培養(yǎng)的HMMCs(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.PDGF-BB刺激HMCs并可以致其活化的最佳濃度和最佳時(shí)間分別

9、是20ng/ml和刺激48h，在此條件下，HMCs的增殖和遷徙能力都達(dá)到最高點(diǎn)(p＜0.05)，免疫熒光也表明各種分子標(biāo)志和細(xì)胞表型都在此時(shí)表達(dá)量最高。此種活化狀態(tài)在逐漸變?nèi)醯那闆r下仍然可以維持大約48h，充足用于刺激并活化HMMCs。2.活化的HMCs可以分泌誘導(dǎo)HMMCs活化的細(xì)胞因子而不會分泌HMMCs活化的細(xì)胞表型和分子標(biāo)志，可以排除后期共培養(yǎng)時(shí)的假陽性結(jié)果。共培養(yǎng)24h HMMCs的細(xì)胞表型表達(dá)量最高，活化后的HMCs只會刺激