惡性膠質(zhì)瘤細胞系的建立及其腫瘤干細胞生物學特性的初步研究.pdf

1、腦腫瘤是成人危害性極大的惡性腫瘤之一，兒童因腫瘤而死亡的主要腫瘤類型，發(fā)病率和死亡率不斷升高，嚴重的威脅著人類的健康和生命。在過去25年里，原發(fā)惡性腦腫瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美國約有18120個新發(fā)腦腫瘤病人，其中約12820個死亡。多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)，顱內(nèi)腫瘤分類屬星形細胞瘤Ⅲ-Ⅳ級，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤之一，約占成人因腫瘤而死亡總?cè)藬?shù)的2.3％。多形性膠質(zhì)母細胞瘤病人占所

2、有膠質(zhì)瘤病人的一半以上，在北美每年約有8000到10000的新發(fā)病例，發(fā)病高峰多在45歲至55歲之間。近十年來，雖然對該腫瘤的病理生理特性有了進一步的理解，但是其治療沒有任何進展。經(jīng)外科手術、甚至聯(lián)合放療與化療，患者愈后仍很差，其中位生存期無明顯改善，一般在9-12個月之間，且病人幾乎無一例外的會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)。 最近研究發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中存在著具有干細胞自我更新特性的細胞亞群即腦腫瘤干細胞(BTSC)，是引發(fā)腫瘤并維持腦腫瘤生長的細

3、胞來源(TIC)，腫瘤干細胞可耐化療、耐放射，在腫瘤的復發(fā)過程中起著決定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原腫瘤組織表現(xiàn)型的腫瘤細胞，它具有三大特點即：無限增殖、自我更新、多潛能分化。在腫瘤球培養(yǎng)基(TSM)培養(yǎng)條件下，可以形成典型的神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，并可表達一系列神經(jīng)干細胞(NSC)特異性標記，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在誘導分化條件下，可以分化表達神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞標記的腫瘤細胞，

4、其表現(xiàn)型與來源腫瘤樣本相同。因此建立體外培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細胞系及分離培養(yǎng)腫瘤干細胞為進一步研究腦腫瘤的發(fā)病機制和細胞生物學特性，為探索新型藥物治療該腫瘤提供了一個較理想的實驗模型。 目的： 1．建立GBM細胞系，初步探討其生物學特性； 2．分離、培養(yǎng)及鑒定GBM腫瘤干細胞，初步探討生物學特性。 方法： 1．GBM原代細胞生長的體外培養(yǎng)條件優(yōu)化 進行GBM原代細胞培養(yǎng)時，分別采用不同的細胞分

5、離、純化方法和培養(yǎng)條件，優(yōu)化最適合GBM的培養(yǎng)條件。分離方法優(yōu)化：分別采用機械分離法、胰酶消化法；純化方法優(yōu)化：差異貼壁法、膠原酶消化法：培養(yǎng)條件優(yōu)化：培養(yǎng)基分別使用DMEM、RPMll640、DMEM/F12。 2．建系細胞株生物學特性初步研究 (1)體外實驗研究：光鏡、電鏡下觀察細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)、MTT法檢測細胞生長曲線及藥物敏感性、克隆形成實驗了解細胞增殖特性、染色體核型分析探討細胞遺傳學特性。 (2)體

6、內(nèi)實驗研究：裸鼠原位接種檢測該細胞株的致瘤性，組織化學染色觀察其病理學特性。 3．GBM腫瘤干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定 通過條件培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)GBM干細胞；細胞計數(shù)法、有限稀釋實驗及流式細胞儀對腫瘤干細胞進行鑒定：原位接種腫瘤干細胞于裸鼠檢測該細胞的致瘤性，組織化學染色觀察其病理學特性，進行體內(nèi)鑒定。 4.GBM腫瘤干細胞生物學特性的初步探討 通過RT-PCR比較單層貼壁生長腫瘤細胞與腫瘤干細胞相關基因表達

7、的差異。通過流式細胞儀(FCM)比較單層貼壁生長細胞與腫瘤干細胞細胞周期、細胞亞群(SP)細胞比例及CDl33陽性細胞含量的差異。 結(jié)論： 1.成功的建立了GBM原代細胞系，優(yōu)化了GBM原代培養(yǎng)條件。 2.該細胞系倍增時間60h，克隆形成率為4.04％，以非整倍體核型為主，可異種移植成瘤，鼠瘤組織表達GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功?？蔀檫M一步研究GBM的發(fā)病機制和細胞分子生物學特性提供較理想的體內(nèi)外實驗

8、模型。 3.順鉑、鬼臼乙甙、丹參酮ⅡA對該GBM細胞系均有顯著的細胞毒作用，并呈劑量和時間效應關系，為研發(fā)新型藥物治療該腫瘤提供了實驗依據(jù)。 4.GBM腫瘤細胞中存在1.33％具有異常增殖能力的BTSC；可以利用條件培養(yǎng)基成功分離和培養(yǎng)BTSC；BTSC在TSM培養(yǎng)環(huán)境中可以增殖，形成連續(xù)傳代的腦腫瘤干細胞球。 5.BTSC表面標志物的檢測：腫瘤球中40.2％的細胞為CDl33陽性細胞，約9.1％的細胞為SP細胞

9、。 6.條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后的GBM細胞僅1000即可在裸鼠原位成瘤：移植瘤與人體來源的原發(fā)腫瘤組織病理表現(xiàn)型一致，裸鼠移植瘤組織中表達CDl33、GFAP及Nestin蛋白，可以作為研究GBM的動物模型。 7.GBM干細胞與單層貼壁細胞相比生物學特性有所改變。相關基因表達的改變：與單層貼壁生長GBM細胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表達較SSM培養(yǎng)細胞增強，GFAP、PTEN表達減弱；細胞周