不同材料包被的SPIO對巨噬細(xì)胞的生物學(xué)影響及磁共振成像效應(yīng).pdf

1、背景介紹與研究目的：
　　 炎癥反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)的部分心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著重要作用，包括T細(xì)胞，B細(xì)胞及大多數(shù)巨噬細(xì)胞在內(nèi)的白細(xì)胞均可遷移到病變部位并聚集。通常評價這些疾病的炎癥反應(yīng)需要組織學(xué)檢查，但這種檢查只能觀察到病變部位炎癥存在的靜止情況，不能動態(tài)的觀察炎癥細(xì)胞遷移到病變部位的過程，而且具有創(chuàng)傷性。如果能實(shí)時并非創(chuàng)性觀察這些疾病的炎癥反應(yīng)，則對疾病的治療及預(yù)后有重要意義。近年來分子影像的迅速發(fā)展使其

2、成為可能。通過超順磁性氧化鐵(SPIO)對巨噬細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，從而示蹤其在體內(nèi)的遷移及分布，能夠動態(tài)非創(chuàng)性的評價體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。當(dāng)SPIO通過靜脈注入體內(nèi)后，隨血液在人體內(nèi)循環(huán)。在體內(nèi)SPIO主要通過肝臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和血液中的吞噬細(xì)胞攝取清除，當(dāng)SPIO被血液中的吞噬細(xì)胞攝取后，并不能再從細(xì)胞內(nèi)排出，這樣便對吞噬細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，而標(biāo)記的吞噬細(xì)胞可以游走到炎癥所在部位并聚集，在磁共振掃描時，會造成炎癥所在部位的T2弛豫時間縮短，從而在磁共

3、振圖像上顯示為信號降低。一般來講，SPIO主要是由內(nèi)核及包被材料兩部分構(gòu)成，納米顆粒內(nèi)徑從十幾納米到幾百納米。內(nèi)核由Fe3O4和/或γFe2O3構(gòu)成，包被材料的種類很多，包被材料的存在提高了SPIO的穩(wěn)定性及生物相容性，而且有包被材料的存在，還可以便于對SPIO進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，從而能夠使SPIO具有靶向性或特異性。到目前為止，已有很多學(xué)者利用SPIO來標(biāo)記被活化的或沒有被活化的巨噬細(xì)胞，并對體內(nèi)炎癥反應(yīng)進(jìn)行評價。這些研究都充分說明利用

4、SPIO標(biāo)記巨噬細(xì)胞對體內(nèi)炎癥反應(yīng)進(jìn)行評價具有很大優(yōu)勢。雖然如此，由于SPIO包被材料和內(nèi)徑存在很大差異性，在這些研究中所利用的SPIO的包被材料及內(nèi)徑大小均不相同，所以得到的結(jié)果可比性較差。如果能定義一種最佳的SPIO用來標(biāo)記巨噬細(xì)胞，不僅標(biāo)記效率高，而且生物相容性高，則對進(jìn)一步的研究有重要意義。但這方面的研究還很少。在本研究中，我們在體外比較了檸檬酸和葡聚糖包被的SPIO對小鼠巨噬細(xì)胞的標(biāo)記效率的不同，并對標(biāo)記后細(xì)胞功能的變化及磁共

5、振成像效應(yīng)進(jìn)行了評價。從而嘗試了解哪種SPIO更適于標(biāo)記巨噬細(xì)胞，為進(jìn)一步的生物應(yīng)用提供試驗基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 按照共沉淀法合成檸檬酸及葡聚糖包被的SPIO。分離6周齡左右的雌性ICR小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。在巨噬細(xì)胞與濃度為0.25mg/ml SPIO共同孵育1小時后，通過普魯士藍(lán)染色對兩種材料包被的SPIO標(biāo)記巨噬細(xì)胞的效率進(jìn)行觀察。濃度分別為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mg/ml的SPIO對巨

6、噬細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，采用Calcein-AM法對不同濃度的SPIO標(biāo)記后的巨噬細(xì)胞活性進(jìn)行評價。巨噬細(xì)胞與濃度為0.5mg/ml的SPIO共同孵育1小時后，通過細(xì)胞劃痕試驗對細(xì)胞的遷移能力的變化進(jìn)行觀察，用imageJ進(jìn)行像素分析來評價細(xì)胞遷移能力的變化。巨噬細(xì)胞與濃度為0.5mg/ml的SPIO共同孵育1小時后，通過酶聯(lián)標(biāo)記法測定標(biāo)記細(xì)胞促炎癥因子IL6的24小時分泌量。0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mg/ml四種濃度的SP

7、IO與巨噬細(xì)胞共同孵育1小時后，用0.5％瓊脂凝膠固定于96孔板，在PHILIPS3.0T磁共振全身掃描儀上進(jìn)行掃描，對不同孵育濃度時弛豫時間的變化進(jìn)行評價。SPIO孵育濃度對細(xì)胞弛豫時間及細(xì)胞活性的影響用雙向方差分析，然后進(jìn)行多重比較分析。SPIO對細(xì)胞遷移能力及促炎癥因子的分泌量的影響通過studentt檢驗進(jìn)行。
　　 結(jié)果：
　　 利用經(jīng)典共沉淀法合成的SPIO為棕黑色膠狀液體，檸檬酸包被的SPIO水合內(nèi)徑約10

8、0nm，檸檬酸包被的SPIO水合內(nèi)徑約150nm，納米粒度分布較好.4℃保存SPIO穩(wěn)定性好。普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示未與SPIO共同孵育的巨噬細(xì)胞被染成均質(zhì)紅色，而與SPIO共同孵育1小時后的巨噬細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒，檸檬酸包被的SPIO明顯比葡聚糖包被的SPIO更易進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，即標(biāo)記效率高。細(xì)胞的活性測定結(jié)果顯示細(xì)胞活性隨SPIO孵育濃度的增加而降低，當(dāng)SPIO孵育濃度為0.25mg/ml起，兩種材料包被的SPIO對細(xì)胞均存在毒性作

9、用。另外通過比較同種孵育濃度兩種包被材料的SPIO細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)兩種包被材料的SPIO在相同的濃度時對巨噬細(xì)胞的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞遷移能力測定結(jié)果顯示兩種包被材料的SPIO標(biāo)記的細(xì)胞的遷移能力無明顯變化，這便說明SPIO不會影響細(xì)胞的遷移能力。促炎癥因子分泌量測定結(jié)果顯示檸檬酸包被的SPIO標(biāo)記的巨噬細(xì)胞促炎癥因子的分泌量增大而葡聚糖包被的SPIO標(biāo)記的細(xì)胞則無增大。在磁共振掃描的結(jié)果中顯示檸檬酸包被的SPIO標(biāo)記的巨噬細(xì)胞可以明顯