日本血吸蟲鈣網(wǎng)織蛋白活化抗原提呈細(xì)胞功能的分析.pdf

1、日本血吸蟲病仍然是流行于我國(guó)的人畜共患病之一，長(zhǎng)期有效地控制病的流行有賴于高效安全疫苗的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)高效、安全、實(shí)用的抗血吸蟲疫苗一直是血防研究中亟待解決的難題。大量研究表明：通過(guò)模擬輻照致弱血吸蟲尾蚴或童蟲疫苗(RAV)誘導(dǎo)的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)理來(lái)研發(fā)高效而又安全的分子疫苗，可能是突破上述難題的有效策略之一。因此，探索RAV的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)課題，其中，RAV的免疫原性的分子與細(xì)胞基礎(chǔ)及其機(jī)制等問(wèn)題尤其受到重視。

2、
　　 以前的研究還顯示：鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin，CRT)是一類進(jìn)化上較為保守的分子，由保守的球狀N端結(jié)構(gòu)域和脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域、以及酸性的C端結(jié)構(gòu)域所組成，屬于Ca2+結(jié)合伴侶蛋白，最初定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾等過(guò)程。最近報(bào)道，經(jīng)某些藥物或紫外照射等處理的腫瘤細(xì)胞以及凋亡的細(xì)胞的CRT會(huì)移位至細(xì)胞表面，從而給巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(Dendritic cells，DC)等抗原提呈細(xì)胞

3、提供了一種“eat me”信號(hào)，最終導(dǎo)致這些細(xì)胞被吞噬和處理；同時(shí)，在這些細(xì)胞的其他應(yīng)急分子的共同作用下，還可增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性。提示細(xì)胞表面CRT的暴露能夠引起其被DC吞噬，從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。另外，Naglaa El Gengehi等人鑒定了曼氏血吸蟲的CRT為輻照致弱疫苗的一種免疫顯性T細(xì)胞抗原，本課題組陳雷等也發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲的CRT(SjCRT)含有一個(gè)雜合型的Th1細(xì)胞表位，說(shuō)明血吸蟲的CRT可能是血吸蟲RAV中的一個(gè)

4、重要的T細(xì)胞抗原。因此，可以推斷，在RA血吸蟲疫苗模型中，來(lái)源于血吸蟲的一些保守的應(yīng)急分子如CRT和HSP70等分子可能起到了關(guān)鍵作用，它們很可能通過(guò)與宿主DC作用，形成引發(fā)和驅(qū)使保護(hù)性的先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的環(huán)境。但是，血吸蟲的CRT分子是否能夠活化宿主的DC誘導(dǎo)特征性的先天免疫反應(yīng)，仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究在克隆表達(dá)日本血吸蟲CRT基礎(chǔ)上，觀察了該分子在血吸蟲不同發(fā)育階段蟲體中的定位情況，并初步分析了SjCRT刺激小鼠抗原提呈

5、細(xì)胞的功能特征，旨在為進(jìn)一步闡明SjCRT在RAV中的免疫生物學(xué)功能和機(jī)制提供初步的資料。
　　 首先，應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)克隆SjCRT分子，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該分子，Western bloting分析了該蛋白分子的免疫原性，免疫熒光法觀察SjCRT分子在不同期別蟲體中的組織定位。結(jié)果克隆和表達(dá)了日本血吸蟲重組蛋白(rSjCRT)；Westen Blot分析顯示，該重組蛋白免疫鼠血清可以識(shí)別7d、14d、23d、32d和

6、42d的日本血吸蟲的蟲體蛋白；免疫熒光檢測(cè)表明在7d、10d、14d日本血吸蟲童蟲體表膜呈現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)。
　　 為避免原核表達(dá)的蛋白含有脂多糖(LPS)而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用Bac-To-Bac桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行SjCRT蛋白的表達(dá)；His柱純化表達(dá)蛋白，Westen Blot分析蛋白免疫原性。結(jié)果在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了SjCRT蛋白；Westen Blot分析顯示，純化后的SjCRT蛋白能夠被標(biāo)簽His單抗識(shí)別，也

7、能被原核表達(dá)SjCRT蛋白的免疫鼠血清所識(shí)別，為后續(xù)活化DC功能的實(shí)驗(yàn)研究提供了材料。
　　 RAW264.7巨噬細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抗原吞噬功能，是常用的研究先天免疫功能的細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)采用以原核表達(dá)后除去LPS的SjCRT蛋白作為抗原觀察其活化RAW264.7細(xì)胞的功能。CCK-8法檢測(cè)SjCRT蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SjCRT蛋白刺激后RAW264.7細(xì)胞表面標(biāo)志分子MHCⅡ和TLR2與TLR

8、4等受體分子的表達(dá)情況。結(jié)果表明，SjCRT蛋白能顯著地刺激RAW264.7細(xì)胞的增殖(SI>2)；SjCRT蛋白刺激后實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞的MHCⅡ、TLR2和TLR4表達(dá)量顯著地增強(qiáng)(P<0.05)。提示SjCRT蛋白能夠刺激RAW264.7細(xì)胞表型的成熟，且可能與TLR2和TLR4受體介導(dǎo)的過(guò)程相關(guān)。
　　 為了解SjCRT是否具有活化宿主樹突狀細(xì)胞的功能，本研究采用上述真核表達(dá)的SjCRT蛋白刺激小鼠骨髓里來(lái)源的D

9、C細(xì)胞，分析刺激后DC表型和功能成熟的情況。常規(guī)方法從Balb/c小鼠骨髓分離、培養(yǎng)和分選得到純度較高的不成熟的DC細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SjCRT蛋白刺激DC細(xì)胞表面標(biāo)志分子MHCⅡ、CD40和CD86的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)刺激的DC細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果顯示，SjCRT蛋白刺激后MHCⅡ和CD86表達(dá)顯著性增強(qiáng)(P<0.05)；DC細(xì)胞分泌到上清中的IFN-γ顯著性增多(P<

10、0.05)，IL-10、TNF-α和IL-6顯著性減少(P<0.05)。提示SjCRT蛋白能夠刺激小鼠骨髓來(lái)源的DC細(xì)胞表型的成熟，且具有促進(jìn)DC細(xì)胞分泌Th1類致炎細(xì)胞因子IFN-γ的功能。
　　 總之，本研究克隆表達(dá)了日本血吸蟲CRT分子，觀察到該分子能夠在7d、10d、14d日本血吸蟲童蟲體表膜呈現(xiàn)，初步查明SjCRT蛋白能夠活化宿主的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，為進(jìn)一步闡明SjCRT在RAV中的免疫生物學(xué)功能和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。