Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法學(xué)及其應(yīng)用研究.pdf

1、現(xiàn)有的致癌性短期預(yù)測遺傳毒性試驗(yàn),大多只限于檢測遺傳毒性致癌物(genotoxiccarcinogen),而不能檢測非遺傳毒性致癌物(non-genotoxiccarcinogen)。建立快速、簡便、可靠的體外方法檢測非遺傳毒性致癌物在藥物早期研發(fā)階段具有重要意義,是當(dāng)前安全性評(píng)價(jià)毒理學(xué)研究中亟需解決的問題。
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)通常采用細(xì)胞灶法判定結(jié)果,但該方法費(fèi)時(shí)且主觀性較強(qiáng)。本研究在細(xì)胞灶法的基礎(chǔ)上,建立以H2O2法判定結(jié)果的B

2、has42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法,并應(yīng)用于藥物安全性評(píng)價(jià)中。Bhas42細(xì)胞是將v-Ha-ras基因?qū)隑alb/c3T3細(xì)胞中而建成的細(xì)胞系,已處于啟動(dòng)狀態(tài),非遺傳毒性致癌物暴露下不經(jīng)過啟動(dòng)劑的預(yù)處理便可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。H2O2可以殺死未發(fā)生轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞,而對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞不產(chǎn)生影響?；瘜W(xué)物處理的細(xì)胞經(jīng)CCK-8染色后,根據(jù)其存活率確定細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度,從而判定化學(xué)物的非遺傳毒性。
　　1、研究方法。
　　本研究包括Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)

3、化試驗(yàn)方法的建立和應(yīng)用二部分。研究內(nèi)容如下:
　　第一部分:實(shí)驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證。1)選用3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene,3-MCA)和佛波醇12-十四酸13-乙酸酯(Phorbol12-myristate13-acetate,TPA)作為陽性劑,在血清批號(hào)等培養(yǎng)條件穩(wěn)定后確定細(xì)胞接種濃度、陽性劑濃度,建立以細(xì)胞灶法判定結(jié)果的Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法。2)通過Balb/c3T3和Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

4、確定CCK-8染色時(shí)間和H2O2濃度與作用時(shí)間點(diǎn),并驗(yàn)證所選條件是否合適。3)選用已知的遺傳毒性致癌物乙基亞硝基脲(N-Nitroso-N-Ethylurea,ENU)和非遺傳毒性致癌物12,13-二癸酸佛波醇(Phorbol12,13-didecanoate,PDD)及石膽酸(Lithochoticacid,LCA)驗(yàn)證以H2O2法判定結(jié)果的Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法。
　　第二部分:實(shí)驗(yàn)方法的應(yīng)用。1)選用兩種植物雌激素染料

5、木黃酮(Genistein,GEN)和葛根素進(jìn)行檢測。2)選用兩種食品添加劑沒食子酸乙酯和甜蜜素進(jìn)行檢測。
　　2、研究結(jié)果
　　1)批號(hào)為737443的胎牛血清培養(yǎng)Bhas42細(xì)胞時(shí),每孔產(chǎn)生的集落數(shù)最多。細(xì)胞生長試驗(yàn)中確定啟動(dòng)試驗(yàn)細(xì)胞接種濃度為200cells·well-1、3-MCA濃度為1μg·ml-1時(shí)相對(duì)生長率接近50％。促癌試驗(yàn)細(xì)胞接種濃度為400cells·well-1、TPA濃度為50ng·ml-1時(shí)相對(duì)生

6、長率接近100%。按以上條件進(jìn)行以細(xì)胞灶法判定結(jié)果的細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),3-MCA和TPA組轉(zhuǎn)化灶個(gè)數(shù)通過卡方檢驗(yàn)(p<0.01)均相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。2)通過Balb/c3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),CCK-8染色4h后OD值基本達(dá)到平穩(wěn),各濃度組之間差距也較明顯。第5組細(xì)胞中0.0012%和0.0020%的H2O2處理的陽性組的OD值均高于陰性組。通過Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對(duì)H2O2濃度進(jìn)一步優(yōu)化,當(dāng)H2O2濃度為0.0016%時(shí),陽性組與

7、陰性組之間的差異最大,且陽性組存活率較高。3)ENU在啟動(dòng)試驗(yàn)中有10、100、150μg·ml-1三個(gè)濃度組相對(duì)于對(duì)照組有顯著差異,且有兩個(gè)為連續(xù)濃度。PDD在促癌試驗(yàn)中0.05、0.1、0.2、0.3、0.4μg·ml-1五個(gè)濃度組相對(duì)于對(duì)照組均有顯著差異。LCA在促癌試驗(yàn)中有5、8、12μg·ml-1三個(gè)連續(xù)濃度組相對(duì)于對(duì)照組有顯著差異(Dunnett-ttest,p<0.01)。4)在啟動(dòng)試驗(yàn)中,GEN和葛根素的各個(gè)濃度組相對(duì)于

8、對(duì)照組均無顯著性差異。在促癌試驗(yàn)中,GEN有0.03、1、3μg·ml-1三個(gè)濃度組相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異,且有兩個(gè)為連續(xù)濃度。葛根素只有3μg·ml-1一個(gè)濃度組相對(duì)對(duì)照組有顯著性差異。5)在啟動(dòng)試驗(yàn)中,沒食子酸乙酯僅1μg·ml-1一個(gè)濃度組相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。而在促癌試驗(yàn)中,沒食子酸乙酯濃度為0.1μg·ml-1時(shí)相對(duì)于對(duì)照組有差異,1、3μg·ml-1時(shí)相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。在啟動(dòng)試驗(yàn)中,甜蜜素濃度為30μg·ml-

9、1時(shí)相對(duì)于對(duì)照組有差異。在促癌試驗(yàn)中,甜蜜素濃度為10μg·ml-1時(shí)相對(duì)于對(duì)照組有差異,濃度為30、300、1000μg·ml-1時(shí)相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異。
　　3、結(jié)論
　　1)試驗(yàn)選用批號(hào)為737443的胎牛血清。啟動(dòng)試驗(yàn)細(xì)胞接種濃度為200cells·well-1、3-MCA濃度為1μg·ml-1,促癌試驗(yàn)細(xì)胞接種濃度為400cells·well-1、TPA濃度為50ng·ml-1進(jìn)行的以細(xì)胞灶法判定結(jié)果的細(xì)胞轉(zhuǎn)化

10、試驗(yàn),3-MCA和TPA組均表現(xiàn)為陽性,證明該方法在本實(shí)驗(yàn)室建立成功。以H2O2法判定結(jié)果的Bhas42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用濃度為0.0016%的H2O2,在第19天處理細(xì)胞24h,CCK-8染色4h后在450nm下測定OD值。三種已知致癌物進(jìn)行驗(yàn)證,均得到陽性結(jié)果,驗(yàn)證了該方法的可靠性和準(zhǔn)確性。
　　4)根據(jù)GEN和葛根素的細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),GEN在啟動(dòng)試驗(yàn)中表現(xiàn)為陰性,而在促癌試驗(yàn)中表現(xiàn)為陽性,表明GEN可能為非遺傳毒性致癌物。葛根素