H2O2在外源GA4解除果梅芽休眠中的作用.pdf

1、梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原產(chǎn)中國，屬薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus L.)植物，在我國的栽培利用已有三千多年的歷史，需冷量范圍比較大，從26.3 CP到75.7CP，在研究果樹季節(jié)性休眠機(jī)制中具有獨(dú)特優(yōu)勢。大量研究發(fā)現(xiàn)，GA4對調(diào)控植物的休眠起到關(guān)鍵的作用，且發(fā)現(xiàn)用GA4噴施果梅枝條可以解除芽的休眠。本研究以果梅為材料，采用紫外分光光度計(jì)法和qRT-PCR技術(shù)，研究了不同處理解除休眠過程中，

2、果梅芽內(nèi)H2O2含量、抗氧化酶類活性的變化;以及抗氧化酶類編碼基因和信號相關(guān)基因的表達(dá)變化。對H2O2在外源GA4解除果梅芽休眠中起到的信號作用進(jìn)行分析。以楊樹組培苗為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將構(gòu)建完成的PmRGL2基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到楊樹組培苗中，測定轉(zhuǎn)基因楊樹苗葉片中的H2O2含量和抗氧化酶類活性;并對抗氧化酶類編碼基因及信號相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析;并采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)，測定了轉(zhuǎn)基因組培苗和楊樹組

3、培苗中的GA4含量。主要結(jié)果如下:
　　1.以高需冷量果梅品種‘豐后’為試材，分別于2013年及2014年果梅樹體自然休眠期多次采集枝條，研究200μM GA4處理和10 mM H2O2以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的H2O2處理對人工氣候室內(nèi)水培枝條萌芽率和H2O2含量、抗氧化酶類活性及H2O2相關(guān)基因和信號相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，200μM GA4處理的枝條花芽的萌芽率明顯高于1％ H2O2、10 mMH2O2處理和對照，且南京地區(qū)

4、最佳處理時期為元旦前后;在GA4處理促進(jìn)果梅休眠解除期間，H2O2含量在果梅花芽休眠解除時達(dá)到峰值，并且控制細(xì)胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生的最主要的基因Respiratory burst oxidase homolog protein E(NADPHoxi-E)以及促進(jìn)H2O2產(chǎn)生的超氧化物歧化酶(SOD)活性以及其編碼基因Superoxide dismutase[Cu-Zn](SOD[Cu-Zn])也在此時達(dá)到峰值。過氧化氫酶(CAT)和過氧化物

5、酶(POD)具有清除H2O2的作用，二者的活性分別在H2O2含量到達(dá)峰值之前和到達(dá)峰值之時受到抑制，但是二者的編碼基因Probable phospholipidhydroperoxide glutathione peroxidase和Catlase1-like的表達(dá)量一直維持在較高水平。央他相關(guān)基因在200μM GA4處理花芽中的表達(dá)也都明顯與其他處理及對照不同，且具有規(guī)律性，這些基因包括:DELLA蛋白基因GAI及赤霉素受體蛋白基因G

6、ID1B-like，Ca/calmodulin-dependent protein kinases related kinase5CDPK-5),Mitogen-activatedprotein kinase9(MAPK-9)以及Calre ticul in-3-l ike（CRT-3-like）?；趯2O2可能在休眠解除期間作為信號物質(zhì)的認(rèn)識，推測GA4打破果梅花芽休眠可能通過相關(guān)基因控制抗氧化酶類活性，調(diào)控H2O2含量的變化，并

7、引起H2O2上下游多種信號相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，最終對休眠解除起作用。
　　2.以二年生高需冷量果梅品種‘豐后’嫁接苗及低需冷量品種‘桃形梅’嫁接苗為試材，采用0～7.2℃模型記錄低溫積累時數(shù)，于果梅需冷量進(jìn)程不同時期對樹體進(jìn)行GA4處理，研究GA4處理人工氣候室內(nèi)果梅嫁接苗葉芽萌芽率和H2O2及抗氧化相關(guān)酶類活性的影響。結(jié)果顯示，GA4處理的果梅葉芽萌芽率明顯高于對照;250μM GA4解除‘桃形梅’葉芽休眠的最佳處理時期為低

8、溫累計(jì)達(dá)到其需冷量的三分之一左右;300肛M GA4解除‘豐后’葉芽休眠的最佳處理時期為低溫累計(jì)達(dá)到其需冷量的二分之一左右。研究發(fā)現(xiàn)GA4和對照處理后，兩個品種葉芽中的抗氧化酶類活性都有不同幅度上升，但是GA4處理后抗氧化酶活性顯著高于對照。且低需冷量果梅品種‘桃形梅’相比高需冷量的果梅品種‘豐后’，具有更高的CAT活性和POD活性，而兩個品種的SOD活性大小并沒有顯著的差異，推測CAT和POD這兩種抗氧化酶在果梅休眠解除過程中起到更重

9、要作用。根據(jù)葉芽內(nèi)H2O2含量和抗氧化酶類活性變化，推測GA4打破果梅葉芽休眠可能與花芽休眠解除類似，都是通過抗氧化酶系統(tǒng)調(diào)控H2O2含量的變化來對休眠解除起作用。
　　3.構(gòu)建了PmRGL2基因過表達(dá)載體，并以楊樹組培苗為試驗(yàn)材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到楊樹中。本研究使用的pYH4215載體具有對潮霉素的抗性，因此轉(zhuǎn)基因苗可以在含有潮霉素的培養(yǎng)基上存活。為進(jìn)一步確定抗潮霉素楊樹植株確實(shí)為轉(zhuǎn)基因植株，除對楊樹葉片

10、進(jìn)行GUS染色外，還提取了轉(zhuǎn)基因楊樹葉片的基因組DNA，以pYH4215載體中潮霉素的基因設(shè)計(jì)特異引物，對轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行PCR檢測。另外，也對轉(zhuǎn)基因楊樹外源PmRGL2進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果初步表明，已經(jīng)將PmRGL2基因成功轉(zhuǎn)入楊樹基因組中。以轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因楊樹苗葉片為材料，測定GA4含量、H2O2含量和抗氧化酶類活性，并對抗氧化酶類編碼基因及赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因楊樹苗中的GA4含量、H2O2含量和NAD

11、PH氧化酶的編碼基因NADPHoxi的表達(dá)量都顯著低于對照;抗氧化酶類活性和對應(yīng)編碼基因的表達(dá)量則高于對照;與赤霉素合成相關(guān)的GA20oxi和GA3oxi的表達(dá)量低于對照，而編碼赤霉素受體蛋白的GID1基因的表達(dá)量顯著高于對照;與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Mitogen-activated protein kinase(MAPK)和CDPK-related kinase1family prote in(CDPK)的表達(dá)量顯著低于對照、而Calret