黃芪甲苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過建立H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷體外模型，觀察黃芪甲苷（Astragaloside IV，AsIV）對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中 t-Akt、p-Akt、t-eNOS、p-eNOS表達(dá)的影響，探討黃芪甲苷是否可以通過激活PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞起到抗氧化應(yīng)激，抗凋亡的保護(hù)作用。
　　方法：應(yīng)用四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色（MTT）法檢測(cè)不同濃度 H2O2對(duì) PC12細(xì)胞作用

2、不同時(shí)間的細(xì)胞存活率，篩選出合適的作用濃度與作用時(shí)間，建立氧化應(yīng)激損傷模型。應(yīng)用 MTT法檢測(cè)不同濃度的黃芪甲苷單獨(dú)作用 PC12細(xì)胞和分別作用于氧化模型的PC12細(xì)胞的存活率，篩選出合適的黃芪甲苷濃度后，將細(xì)胞進(jìn)一步分成四組：正常對(duì)照組、H2O2模型組、黃芪甲苷+H2O2組、LY294002+黃芪甲苷+H2O2組。應(yīng)用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒測(cè)定LDH含量，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，通路相關(guān)蛋

3、白t-Akt、p-Akt、t-eNOS、p-eNOS的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，黃芪甲苷濃度在10~400nmol/L組單獨(dú)作用于 PC12細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響作用；PC12細(xì)胞活力與H2O2濃度及其作用的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞活力隨H2O2濃度增大而下降，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而下降。其中300μmol/L H2O2組，當(dāng)作用時(shí)間為4h時(shí)細(xì)胞活力下降約為53％，達(dá)到PC1

4、2半數(shù)致死量，因此選取300μmol/L H2O2作用4h制建立 H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。不同濃度黃芪甲苷（100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L）預(yù)處理組與 H2O2模型組相比，PC12細(xì)胞存活率均有所提高，而以黃芪甲苷（100nmol/L）處理組作用最為顯著(P＜0.05)。2、LDH測(cè)定結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組中PC12細(xì)胞上清液中LDH活性明顯升高（P＜0.05），對(duì)細(xì)胞具有

5、明顯的損傷作用；與H2O2模型組相比，在黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞上清液中LDH含量（P＜0.05），減少細(xì)胞損傷；與黃芪甲苷預(yù)處理組（黃芪甲苷+H2O2組）相比，在LY294002+黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理前用LY294002處理后使H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞上清中LDH含量上升（P＜0.05）。3、western blot法檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組中凋亡相關(guān)蛋

6、白 Caspase-3的表達(dá)明顯增高（P＜0.05），促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生；與 H2O2模型組相比，在黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理能顯著減少H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，抑制凋亡的進(jìn)展（P＜0.05），能明顯上調(diào)Akt及eNOS磷酸化表達(dá)（P＜0.05）；與黃芪甲苷預(yù)處理組（黃芪甲苷+H2O2組）相比，在 LY294002+黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理前用LY294002處理后H2

7、O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞能夠明顯抑制 Akt及 eNOS磷酸化表達(dá)（P＜0.05），提示黃芪甲苷可能通過激活 PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用的。
　　結(jié)論：黃芪甲苷預(yù)處理對(duì) H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路密切相關(guān)。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過建立 H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷體外模型，觀察黃芪甲苷（Astragalos

8、ide IV，AsIV）對(duì) H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中 t-Akt、p-Akt、t-eNOS、p-eNOS表達(dá)的影響，探討黃芪甲苷是否可以通過激活 PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞起到抗氧化應(yīng)激，抗凋亡的保護(hù)作用。
　　方法：應(yīng)用四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色（MTT）法檢測(cè)不同濃度 H2O2對(duì) PC12細(xì)胞作用不同時(shí)間的細(xì)胞存活率，篩選出合適的作用濃度與作用時(shí)間，建立氧化應(yīng)激損傷模型。應(yīng)用 MTT法檢測(cè)不同

9、濃度的黃芪甲苷單獨(dú)作用 PC12細(xì)胞和分別作用于氧化模型的PC12細(xì)胞的存活率，篩選出合適的黃芪甲苷濃度后，將細(xì)胞進(jìn)一步分成四組：正常對(duì)照組、H2O2模型組、黃芪甲苷+H2O2組、LY294002+黃芪甲苷+H2O2組。應(yīng)用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒測(cè)定LDH含量，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，通路相關(guān)蛋白t-Akt、p-Akt、t-eNOS、p-eNOS的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、MTT法檢測(cè)

10、細(xì)胞存活率結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，黃芪甲苷濃度在10~400nmol/L組單獨(dú)作用于 PC12細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響作用；PC12細(xì)胞活力與H2O2濃度及其作用的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組PC12細(xì)胞活力隨H2O2濃度增大而下降，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而下降。其中300μmol/L H2O2組，當(dāng)作用時(shí)間為4h時(shí)細(xì)胞活力下降約為53%，達(dá)到PC12半數(shù)致死量，因此選取300μmol/L H2O2作用4h制建立 H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)

11、激損傷模型。不同濃度黃芪甲苷（100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L）預(yù)處理組與 H2O2模型組相比，PC12細(xì)胞存活率均有所提高，而以黃芪甲苷（100nmol/L）處理組作用最為顯著(P＜0.05)。2、LDH測(cè)定結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組中PC12細(xì)胞上清液中LDH活性明顯升高（P＜0.05），對(duì)細(xì)胞具有明顯的損傷作用；與H2O2模型組相比，在黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理降低H2O2誘導(dǎo)的P

12、C12細(xì)胞上清液中LDH含量（P＜0.05），減少細(xì)胞損傷；與黃芪甲苷預(yù)處理組（黃芪甲苷+H2O2組）相比，在LY294002+黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理前用LY294002處理后使H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞上清中LDH含量上升（P＜0.05）。3、western blot法檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，H2O2模型組中凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3的表達(dá)明顯增高（P＜0.05），促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生；與 H2O2模型組相比

13、，在黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理能顯著減少H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，抑制凋亡的進(jìn)展（P＜0.05），能明顯上調(diào)Akt及eNOS磷酸化表達(dá)（P＜0.05）；與黃芪甲苷預(yù)處理組（黃芪甲苷+H2O2組）相比，在 LY294002+黃芪甲苷+H2O2組中，黃芪甲苷預(yù)處理前用LY294002處理后H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞能夠明顯抑制 Akt及 eNOS磷酸化表達(dá)（P＜0.05），提示黃芪甲苷可能