柿及其部分近緣種mtDNA和cpDNA多態(tài)性分析.pdf

1、柿為柿科柿屬植物。本試驗基于胞質基因組，包括線粒體基因組和葉綠體基因組具有母性遺傳等特點，分別對柿及其部分野生近緣種材料涵蓋了7個種(柿；君遷子；浙江柿；油柿；金棗柿；老鴉柿；美洲柿)進行親緣關系分析，以期從胞質基因組。DNA水平上明確柿品種、種的親緣關系和分類地位，為柿屬植物資源利用提供科學依據(jù)。主要結果如下： 1．應用在其他高等植物開發(fā)的34對mtDNA特異引物，對柿屬植物6個近緣野生種及柿種下20個品種線粒體基因非編碼區(qū)。

2、DNA序列進行．PCR擴增。結果表明：1)選用的32對引物能擴增線粒體基因間隔區(qū)和內含子區(qū)域，并檢測到110個變異位點，說明mtDNA在序列進化和基因重組過程中存在大量變異；2)其中23對引物能檢測到栽培柿種下擴增多態(tài)位點，聚類分析表明原產中國甜柿種質和日本甜柿種質完全分開，兩者可能具有不同起源；3)中國原產甜柿寶蓋甜柿和鄂柿一號具有部分特異譜帶，根據(jù)線粒體基因組母系遺傳規(guī)律，推斷其可能具有相同母本。 2．應用10對葉綠體DNA

3、通用引物對柿屬植物6個近緣野生種和柿種內23個品種的葉綠體基因組非編碼區(qū)DNA序列進行PCR擴增。共擴增柿屬植物cpl)NA約20.4 kb，占其葉綠體基因組12.7％。擴增產物分別應用7種限制性內切酶酶切，瓊脂糖電泳檢測結果表明：1)cpDNA在柿屬植物中存在豐富的種間多態(tài)性，但柿種各基因型未能檢測到明顯的遺傳變異位點，僅在trnS-trnfM/RsaI組合檢測到雄株9號位點變異；2)栽培柿酶切譜帶模式與4倍體老鴉柿和6倍體美洲柿差異

4、明顯，而與君遷子差異最小。3)應用NTSYS程序中主坐標分析和PHYLIP中Wagner簡約法分析得出，在柿進化過程中2倍體的君遷子、浙江柿親緣關系較近，而與多倍體的美洲柿和老鴉柿卻相距甚遠；4)金棗柿產生與柿屬植物其他種不同的譜帶模式，綜合形態(tài)學特征推斷其為柿的一個新近緣種。 3．應用通用引物擴增10個柿屬基因型(包括9個柿品種和1個近緣種)葉綠體基因組trnS-trnfM區(qū)域，克隆測序得長度為1155bp～1160bp的核苷

5、酸序列，包含trnS，psbZ，trnG和trnfM基因編碼序列及其基因間隔區(qū)序列。共檢測出17個序列突變位點，包括11個堿基替換，3個堿基插入和3個堿基缺失位點。供試中國原產柿品種突變位點2個，日本原產柿品種為14個，差異顯著。相對古老的柿品種此區(qū)域序列保守且高度同源，而近期選育出的陽豐變異水平最高，部分變異位點與母本富有相同。鄰接法分析結果表明原產中國的柿種質與日本柿種質分別聚類，推測兩者具有不同起源。序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結果均表

6、明中國原產完全澀柿磨盤柿與完全甜柿寶蓋甜柿和鄂柿1號起源親本親緣關系較近。 4．應用mtDNA通用引物特異擴增柿線粒體基因組ORF25區(qū)域，并對目的片段進行克隆測序，通過序列比較檢測柿品種間mtDNA ORF25區(qū)域序列多態(tài)性，鑒定目的片段為特異擴增產物。結果表明此區(qū)域存在部分堿基變異位點，且發(fā)生了序列拷貝。系統(tǒng)分析表明不完全甜柿禪寺丸和不完全澀柿平核無分化時間較短。選取中國和日本不同脫澀類型、不同倍性的柿屬植物對12對cpSS

7、R引物進行通用性檢測，并初步探究其應用潛力。來源于柑橘類ARCP4，ARCP5，ARCP9和來源于煙草ccmp3，NTCP9，NTCP40的6對cpSSR引物能夠在供試材料中擴增得到目的片段。結果表明，在其他作物開發(fā)的cpSSR引物具有較高的通用性，在柿屬植物的葉綠體基因組研究領域具有潛力。 5．以完全澀柿磨盤柿為母本，授以完全甜柿羅田甜柿花粉，進行大田雜交育種。熒光顯微鏡檢測花粉與柱頭親和性，應用胚挽救技術對所得到的種子進行幼

8、胚培養(yǎng)獲得雜交后代植株。應用RAPD和SSR分子標記對F<,1>代遺傳分析，并與原產中國部分甜柿種質比較。羅田甜柿花粉在磨盤柿柱頭上可以萌發(fā)，但大多數(shù)產生胼胝質塞，親和力較低，僅有少量正常受精。磨盤柿為單性結實，并具有有性雜交能力。在磨盤柿×羅田甜柿186個人工授粉處理中共得到82個果實，13個種子；RAPD和SSR檢測結果表明所獲得的幼胚培養(yǎng)植株為其F<,1>代，部分單株與寶蓋甜柿和鄂柿1號等中國現(xiàn)有甜柿種質擴增圖譜部分位點相同。

9、 綜上所述，本研究應用通用引物特異擴增部分柿屬植物的胞質基因組，包括線粒體基因組和葉綠體基因組的部分區(qū)域，擴增產物直接通過瓊脂糖凝膠檢測、限制性內切酶酶切和克隆測序比較供試材料的遺傳多態(tài)性，并應用UPGMA、主坐標分析和Wanger簡約法進行聚類，分析遺傳關系。胞質基因組所反映的材料間的遺傳關系與總基因組多種分子標記分析結果大致相同。分析結果表明：1)柿mtDNA存在豐富變異；2)cpDNA PCR-RFLP可適用柿屬植物種間水平系