DcR3反義RNA對肝癌的作用及與順鉑協同效應的觀察.pdf

1、山東大學博士學位論文DcR3反義RNA對肝癌的作用及與順鉑協同效應的觀察姓名：段偉宏申請學位級別：博士專業(yè)：外科學指導教師：吳泰璜20050101爾人學I尊十學何論文段與誘發(fā)細胞凋亡有關。作為生物治療重點部分的誘導凋亡治療將成為人類征服肝癌的有力手段。DecoyReceptor3(DcR3)是1998年PittiRIvl首先發(fā)現的一種陷阱分子，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，DcR3基因定位于染色體20q133上，該基因編碼一種無明顯跨

2、膜序列的分泌型蛋白，能特異性結合FasL，阻斷由Fas／FasL系統介導的細胞凋亡。研究表明，部分人類惡性腫瘤(肺癌、胃癌、肝癌等)中存在DcR3基因過度表達及擴增，而且這種過度表達僅發(fā)生于腫瘤細胞，腫瘤周圍J下常組織則檢測不到該基因的表達。后續(xù)研究發(fā)現，DcR3基因過度表達與腫瘤免疫逃逸及抵抗機體細胞凋亡機制有關。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前國際上對該基因研究并不充分，但是鑒于DcR3與肝癌細胞凋亡的密切關聯及它在肝癌患者血清中特

3、異地高表達，我們認為DcR3是一個有較高研究價值的基因，明確它在幫助肝癌細胞逃避免疫監(jiān)視及免疫殺傷中的作用，阻斷其表達對肝癌細胞之凋亡有無促進成為我們研究的目標。第一部分DcR3反義RNA構建及表達目的：DcR3(decoyreceptor3)屬于腫瘤壞死因予受體超家族成員，能競爭性地結合LIGHT及FasL，抑制LIGHT及FasL介導的細胞凋亡，使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視及免疫殺傷而得以存活。本實驗利用反義RNA技術觀察在DcR3基因片

4、段與其反義DcR3基因片段結合后，凋亡有無增加與傳統化療藥順鉑比較，何者促凋亡效應更強二者是否具有協同效應為此，第一部分實驗首先構建DcR3反義RNA，將其轉染腫瘤細胞，比較其表達情況。方法：從新鮮肝癌細胞中提取總RNA，在DcR3基因序列引物限制下進行RTPCR反應，得到大量DcR3的DNA片段，將該基因片段進行電泳鑒定并做基因測序分析，確定之后對其進行BamHI、XholI雙酶切，使DcR3片段粘性末端裸露；同時對質粒PVAXI(一

5、)進行BamHI、XholI雙酶切；將此具有粘性末端的二者在T4DNA連接酶的作用下進行反義連接，得到PVAXIasDcR3，將其轉染肝癌細胞株SMMC7721，之后以Bactin為內參照，用WesternBlot方法檢測單純肝癌細胞株SMMC一7721組、轉染了PVAXIasDcR3的肝癌細胞株SMMC一7721組、轉染了空質粒PVAXI的肝癌細胞株SMMC7721組，比較三組蛋白表達量有無差別。結果：對DcR3基因片段進行電泳鑒定，