聽神經(jīng)病譜系障礙基因突變篩查及NELL2基因在出生后小鼠耳蝸的表達(dá)研究.pdf

1、第一部分常染色體顯性遺傳性聽神經(jīng)病譜系障礙家系鑒定及基因篩查
　　目的:針對本課題組收集到的一個聽神經(jīng)病譜系障礙(ANSD)家系進(jìn)行臨床聽力學(xué)檢查及相應(yīng)系統(tǒng)檢查,明確發(fā)病特點及分析遺傳學(xué)特點,并對該家系進(jìn)行聾病基因篩查以期明確致病基因。
　　方法:該家系4代共24人作為研究對象,進(jìn)行ABR、EOAE、言語分辨率、電子耳鏡、聲導(dǎo)抗測聽、顳骨薄層CT及內(nèi)聽道MRI等檢查,并詳細(xì)查體及詢問病史排除系統(tǒng)性疾病。在確定遺傳特點的基礎(chǔ)上

2、,對已知聾病基因進(jìn)行篩查,采集受試者外周靜脈血提取基因組 DNA,應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件 Primers進(jìn)行引物設(shè)計,采用直接測序法對已知ANSD相關(guān)基因進(jìn)行測序,使用DNAMan軟件對序列進(jìn)行比對分析。在前述實驗基礎(chǔ)上,進(jìn)行全基因組外顯子測序,首先采集兩名患者及一名正常家系成員行全外顯子測序,對初篩基因與 NCBI基因庫數(shù)據(jù)進(jìn)行表型及功能鑒定排除與ANSD無關(guān)聯(lián)的基因突變,初步確定可能致病基因,再將家系所有患者樣本與前述初篩樣本進(jìn)行連鎖

3、分析,最終確定候選基因。
　　結(jié)果:該家系24人中有4人符合非綜合征型ANSD診斷,連續(xù)三代發(fā)病,男女發(fā)病比例均等,符合常染色體顯性遺傳疾病特點。對家系中全部患者及部分聽力正常成員完成 ANSD相關(guān)的常染色體顯性遺傳基因 DIAPH3、常染色體隱性遺傳基因OTOF、PJVK及非綜合征型耳聾致病基因GJB2、GJB3基因外顯子及線粒體DNA12S rRNA1494、1555位點的測序分析,均未發(fā)現(xiàn)可疑致病突變。經(jīng)全基因組外顯子測序,

4、該家系中初篩樣本中檢出堿基突變260個,經(jīng)與家系中健康成員比對,篩出可能致病突變47個,在進(jìn)行表型、功能鑒定后及與家系其他成員連鎖分析后發(fā)現(xiàn),全部患者存在NELL2基因的錯義突變(c457F),而聽力正常成員及散發(fā)ANSD患者未見該突變存在。
　　討論:該家系發(fā)病符合常染色體顯性遺傳性非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙,但是基因篩查未能檢測到目前已知聾病基因在該家系患病成員中發(fā)生突變,提示可能存在未知的致病基因。而全基因組外顯子測序則提示

5、本家系全部患者存在NELL2基因的突變,經(jīng)與哈佛大學(xué)基因文庫檢索發(fā)現(xiàn)該基因在耳蝸內(nèi)有表達(dá),高度提示可能是新的ANSD致病基因,具體功能有待于進(jìn)一步研究。
　　第二部分 NELL2基因在出生后小鼠耳蝸內(nèi)的表達(dá)研究
　　目的:基于ANSD家系聾病基因篩查結(jié)果,研究NELL2基因在出生后小鼠耳蝸內(nèi)表達(dá)分布規(guī)律。
　　方法:以C57小鼠為實驗動物,選擇出生后0天、3天、7天、14天、28天為時間節(jié)點,采用免疫熒光染色、West

6、ern Blot及RT-PCR技術(shù),從蛋白和mRNA水平觀察小鼠出生后不同發(fā)育階段NELL2基因在耳蝸的表達(dá)與分布規(guī)律。
　　結(jié)果:NELL2在小鼠耳蝸有表達(dá),并呈現(xiàn)隨著日齡遞增表達(dá)逐漸增強(qiáng)的趨勢。表達(dá)部位是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元及內(nèi)柱細(xì)胞、外柱細(xì)胞胞漿內(nèi)。P0、P3期Corti器形態(tài)不成熟,此時該區(qū)域NELL2表達(dá)不明顯,從P7開始至P28隨著Corti器的成熟,免疫熒光顯示NELL2表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢,在螺旋神

7、經(jīng)元的表達(dá)則從P0開始呈現(xiàn)持續(xù)逐漸增強(qiáng)的趨勢。Western Blot檢測結(jié)果顯示蛋白表達(dá)趨勢與免疫熒光染色一致,數(shù)據(jù)分析有統(tǒng)計學(xué)意義。但是RT-PCR結(jié)果顯示無論是在毛細(xì)胞還是螺旋神經(jīng)元,NELL2 mRNA表達(dá)峰值均出現(xiàn)在P7,P14、P28則較之呈下降趨勢。
　　討論:我們的實驗證實NELL2在出生后小鼠耳蝸有表達(dá),并且隨著小鼠日齡的增加NELL2蛋白的表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的趨勢,并與Corti器形態(tài)的成熟和聽功能的形成在時間點上