中國(guó)人群兒童孤獨(dú)癥的CDRO2B基因關(guān)聯(lián)研究及PAK2基因突變篩查.pdf

1、孤獨(dú)癥譜系障礙性疾病(Autism Spectrum Disorders，ASD)是一種嚴(yán)重影響兒童健康的神經(jīng)發(fā)育性疾病，一般為3歲前發(fā)病，男女發(fā)病比例為4∶1，最新流行病學(xué)調(diào)查顯示ASD發(fā)病率已高達(dá)1/50。ASD具有高度的臨床異質(zhì)性，其三個(gè)典型的臨床癥狀為語言障礙、社交障礙以及重復(fù)刻板的行為。近年來，通過染色體核型分析，全基因組連鎖分析，全基因組拷貝數(shù)變異研究以及全基因組關(guān)聯(lián)研究，已經(jīng)鑒定了多個(gè)ASD相關(guān)的易感位點(diǎn)和基因。這些基因大

2、多與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元可塑性、突觸連接功能以及神經(jīng)環(huán)路相關(guān)。
　　第一章:中國(guó)人群兒童孤獨(dú)癥的COR02B基因關(guān)聯(lián)研究
　　研究背景:我們前期的研究發(fā)現(xiàn)一例孤獨(dú)癥患者攜帶一個(gè)新發(fā)單拷貝數(shù)缺失，這個(gè)拷貝數(shù)變異包含CLN6、CORO2B、SENP8等31個(gè)基因。通過功能候選，我們認(rèn)為CORO2B很可能與孤獨(dú)癥發(fā)病相關(guān)。另外我們之前的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)結(jié)果也表明CORO2B上的多個(gè)單核苷酸多態(tài)(SNP)與孤獨(dú)癥相關(guān)。

3、>　　研究目的:本研究將在我們新收集的一批孤獨(dú)癥樣本中對(duì)我們前期的關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以探索CORO2B與中國(guó)人群孤獨(dú)癥發(fā)病的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)方法:利用Haploview挑選前期研究中與孤獨(dú)癥具有相關(guān)性的連鎖不平衡區(qū)域的標(biāo)簽SNP(rs1465997)，用primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）對(duì)該位點(diǎn)兩側(cè)的堿基序列設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增該片段并用Sanger測(cè)序法進(jìn)行直接測(cè)序。用DN

4、AStar中的SeqMan進(jìn)行分析，檢測(cè)該位點(diǎn)的基因型。用plink（http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink/）做哈代溫伯格平衡(HWE)檢驗(yàn)和傳遞不平衡關(guān)聯(lián)分析(TDT)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:分型的270個(gè)核心家系在該SNP位點(diǎn)均符合孟德爾遺傳定律。最小等位基因頻率為0.24，基因型分布符合HWE定律(p=0.25)。傳遞不平衡關(guān)聯(lián)分析結(jié)果無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.0522)且優(yōu)勢(shì)比與前

5、期GWAS結(jié)果不一致(OR=0.76)。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未能驗(yàn)證之前GWAS的結(jié)果。CORO2B該位點(diǎn)在本研究樣本中與中國(guó)人群孤獨(dú)癥不相關(guān)。
　　第二章:中國(guó)人群兒童孤獨(dú)癥的PAK2基因突變篩查
　　研究背景:PAK2(P21蛋白激酶2)基因位于染色體3q29，含14個(gè)外顯子，編碼524個(gè)氨基酸。已有研究表明PAK1和PAK3突變與認(rèn)知障礙疾病相關(guān)。PAK2位于3q29微缺失綜合癥(OMIM＃609425)和3q

6、29微重復(fù)綜合癥（OMIM＃611936）拷貝數(shù)變異區(qū)間內(nèi)。這兩個(gè)綜合征均存在智力低下和/或?qū)W習(xí)障礙，語音延遲和孤獨(dú)癥表型。這些證據(jù)表明PAK蛋白對(duì)神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要，PAK家族基因的變異很可能與神經(jīng)發(fā)育性疾病相關(guān)，如孤獨(dú)癥等。
　　研究目的:本研究在中國(guó)人群孤獨(dú)癥患者中篩查PAK2基因突變，探索PAK2基因突變是否與中國(guó)人群孤獨(dú)癥相關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:在UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中找到PAK2

7、基因編碼區(qū)和5'UTR區(qū)堿基序列。以PAK2基因編碼區(qū)和5'UTR區(qū)堿基序列為目的片段用 primer3設(shè)計(jì)引物(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)。對(duì)設(shè)計(jì)出的引物片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并用Sanger測(cè)序法進(jìn)行直接測(cè)序。用DNAStar中的SeqMan進(jìn)行分析。以UCSU中查到的序列(NM_002577)為標(biāo)準(zhǔn)，分析PAK2基因的編碼區(qū)和5'UTR區(qū)變異位點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:本研究在312個(gè)孤獨(dú)癥患者

8、中共鑒定了10個(gè)變異。其中4個(gè)位于PAK2基因編碼區(qū)域，均為同義突變。2個(gè)位于5，UTR區(qū)，為c.-191C＞T和c.-167G＞T。變異c.-191C＞T在dbSNP數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道，變異c.-167G＞T為已知多態(tài)。另外4個(gè)變異位于外顯子剪接位點(diǎn)附近的內(nèi)含子區(qū)(c.289-3t＞a， c.576+14g＞a，c.1154-21_1154-20instgttt,c.1350+8g＞c)。變異c.576+14g＞a在dbSNP數(shù)據(jù)庫中未