SIAH2與Bcl-2在乳腺癌中的表達及相關(guān)性研究.pdf

1、前言:乳腺癌是女性一種常見的惡性腫瘤,已成為女性腫瘤患者死亡的主要原因。乳腺癌的發(fā)生經(jīng)歷了以下幾個階段:正常導管上皮→普通型導管上皮增生→不典型導管上皮增生→導管原位癌→浸潤性導管癌,探討與乳腺癌動態(tài)發(fā)展過程相關(guān)基因的改變對治療乳腺癌具有重要意義。
　　 SIAH2蛋白具有E3泛素連接酶的活性,可調(diào)節(jié)一些蛋白的泛素化和降解,這些蛋白包括DCC,Bag-1,TRAF2,PHD1/3,Spry2等。近來發(fā)現(xiàn)SIAH2可作為一種重要的

2、腫瘤因子發(fā)揮生物學作用,SIAH2在有增殖能力的細胞中表達(正常和瘤細胞),如宮頸癌細胞,乳腺癌細胞,人胚腎細胞及結(jié)直腸腺瘤組織等,而在不增殖的細胞中表達缺失。研究報導抑制SIAH2的功能后能夠阻斷ERK信號通路,抑制軟瓊脂中胰腺癌細胞的自主生長和裸鼠體內(nèi)胰腺腫瘤的形成,最近研究發(fā)現(xiàn)SIAH2在幾乎所有類型肺癌組織中均有表達,并且隨著肺癌分化程度的降低SIAH2的表達顯著增加,而在正常肺組織中幾乎不表達。Bcl-2是程序性細胞死亡的關(guān)鍵

3、調(diào)節(jié)因子,它既能夠與自身形成同源二聚體,也可以與Bcl-2家族其他蛋白形成異源二聚體。眾所周知Bcl-2能夠有效抑制Bax的凋亡作用,Bcl-2通過與Bak相互作用抑制Bax的構(gòu)象改變,并且能夠阻止Bax從胞漿到線粒體膜的易位,從而抑制細胞凋亡。
　　 最近有研究發(fā)現(xiàn)抑制SIAH2的功能可以使其底物蛋白Spry2水平上調(diào)從而抑制ERK的磷酸化,進而調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡。而PD98059抑制ERK的活性后能夠下調(diào)Bcl-2的表達。所

4、以我們推測SIAH2可能通過ERK通路來調(diào)控Bcl-2,本研究目的旨在探討乳腺組織及細胞系中SIAH2和Bcl-2的表達情況及與臨床病理學參數(shù)的意義,探討在乳腺癌細胞中干擾SIAH2的功能后Bcl-2表達的變化。
　　 材料與方法:
　　 1、材料
　　 180例乳腺組織標本(包括33例正常乳腺組織,28例乳腺不典型增生組織,39例乳腺導管原位癌組織和80例乳腺浸澗性導管癌組織),均取自中國醫(yī)科大學第一臨床學院2

5、007-2009年腫瘤外科手術(shù)切除的標本,所有患者術(shù)前均未接受放、化療。標本經(jīng)4％中性甲醛固定,石蠟包埋,HE常規(guī)染色后明確診斷。其中部分癌組織和正常乳腺組織離體后立即放入液氮后-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?株乳腺癌癌細胞系(MDA-MB-435S和MCF7),1株人乳腺正常上皮細胞系(MCF-10A)。用含10％新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5％CO2的條件下培養(yǎng)。
　　 2、主要試劑和來源SIAH2鼠單克隆抗體,SIAH

6、2 siRNA,Bcl-2鼠單克隆抗體均購自美國SantaCruz公司。SP免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。
　　 3、方法
　　 (1)免疫組織化學染色及結(jié)果判定標本固定,石蠟包埋,制成4μm連續(xù)切片,采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化法(S-P法)檢測SIAH2和Bcl-2蛋白表達。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。結(jié)果判定:SIAH2以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色,B

7、cl-2以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。高倍視野(×400)下選陽性信號最強區(qū)域計數(shù)200個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù),根據(jù)免疫組化染色強度分為三個等級:淺黃色計為1分,棕黃色計為2分,黃褐色計為3分。按SIAH2和Bcl-2表達百分率分為以下四個等級:0％為0分,1％-50％為1分,51％-75％為2分,＞75％為3分。以染色強度和陽性細胞率的分值乘積作為每一例的積分,積分＜4者判定為陰性,積分≥4為陽性。
　　 (2)West

8、ern Blot在收集的細胞內(nèi)加入裂解液充分裂解,低溫高速離心(4℃,15000轉(zhuǎn)/min,30min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60μg。電泳(12％SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉,一抗SIAH2(1:200)、Bcl-2(1:200)和β-actin(1:200),4℃孵育過夜,分別與各自對應的二抗(1:4000)室溫孵育2小時,ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動凝膠成像分析儀采集,進行灰度值測定,β-actin做內(nèi)參。<

9、br>　　 (3)siRNA干擾實驗分三組:空白對照組、非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和特異性siRNA轉(zhuǎn)染組,每個實驗均重復三次,轉(zhuǎn)染具體步驟按Lipofect2000試劑說明書進行。
　　 4、統(tǒng)計分析
　　 各組資料應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組織化學結(jié)果SIAH2蛋白主要在細胞核表達,Bcl-2蛋白主要在細胞漿表達。在乳腺癌癌變過

10、程(正常乳腺組織,不典型導管增生,導管原位癌,浸潤性導管癌)中SIAH2和Bcl-2蛋白的陽性表達率呈逐漸升高趨勢。兩者表達水平均與乳腺癌組織學分級明顯相關(guān)。在80利乳腺癌中SIAH2與Bcl-2蛋白表達呈正相關(guān)。
　　 2、Westem Blot結(jié)果SIAH2蛋白和Bcl-2蛋白在乳腺癌組織及細胞系中的表達明顯高于正常乳腺組織及細胞系,用SIAH2siRNA干擾乳腺癌細胞系MCF7和MDA-MB435S中SIAH2的功能后Bc