水蛭酶解物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、水蛭作為活血化瘀藥材的一種，臨床上常用于治療心血管疾病，并且療效顯著。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年研究采用可控酶解技術(shù)，制備獲得低分子量的水蛭酶解物，具有抗凝血、防治中風(fēng)和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本課題建立在前期研究基礎(chǔ)之上，通過(guò)體外構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化病理特征性細(xì)胞——泡沫細(xì)胞，觀察水蛭酶解物對(duì)泡沫細(xì)胞形成的抑制作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。論文主要內(nèi)容如下:
　　1.構(gòu)建泡沫細(xì)胞
　　采用80μg/ml的oxLDL作用于巨噬細(xì)胞系24h后

2、形成泡沫細(xì)胞。并對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色和膽固醇含量測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證，油紅O染料染色結(jié)果顯示oxLDL可以誘導(dǎo)RAW246.7巨噬細(xì)胞系形成泡沫細(xì)胞，顯微鏡下觀察，oxLDL作用后細(xì)胞胞體變大，胞內(nèi)紅色顆粒物質(zhì)增多。通過(guò)膽固醇含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)隨著oxLDL劑量的增加，泡沫細(xì)胞形成比例逐漸增加，oxLDL濃度達(dá)到80μg/ml時(shí)，與空白組相比，胞內(nèi)TC、FC、CE水平顯著升高(p＜0.01)，且CE/TC＞50％。流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位發(fā)現(xiàn)o

3、xLDL作用24h后細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降。經(jīng)Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，結(jié)果表明隨著oxLDL濃度的增加，部分細(xì)胞核質(zhì)濃縮呈致密濃染，表明細(xì)胞核受到氧化損傷。DNAladder發(fā)現(xiàn)，oxLDL可使細(xì)胞核內(nèi)DNA產(chǎn)生氧化斷裂片段，產(chǎn)生500bp以下的DNA片段。上述結(jié)果表明:80μg/ml的oxLDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)oxLDL對(duì)泡沫細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷。
　　2.水蛭酶解物對(duì)泡沫細(xì)胞的作用
　　

4、MTT結(jié)果顯示300μg/ml以下水蛭酶解物對(duì)細(xì)胞的活力無(wú)影響。選取75μg/ml，150μg/ml和300μg/ml低中高濃度水蛭酶解物作用于泡沫細(xì)胞24h后，膽固醇含量測(cè)定結(jié)果顯示胞內(nèi)TC、FC和CE含量均顯著性下降并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，其中中、高劑量組CE/TC＜50％效果明顯。油紅O染色發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)紅色顆粒明顯減少，表明水蛭酶解物能夠降低泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，并對(duì)泡沫細(xì)胞的形成具有抑制作用。流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體膜電位結(jié)果表明膜電位的下降

5、也受到一定程度的抑制;Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核質(zhì)濃縮比例下降;DNAladder圖中DNA斷裂片段減少。以上結(jié)果表明:水蛭酶解物對(duì)泡沫細(xì)胞的形成具有抑制作用，并具有抗oxLDL對(duì)泡沫細(xì)胞的氧化損傷作用。
　　3.水蛭酶解物抑制泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制
　　MDC染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水蛭酶解物作用于泡沫細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒增多，用自噬抑制劑3-MA處理后，熒光顆粒減少;Westernblot顯示，水蛭酶解物處理后LC3Ⅱ/

6、LC3Ⅰ比值上升，用3-MA處理后比值有所下降;同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)3-MA處理后油紅O染色顆粒增加，膽固醇含量升高。線粒體膜電位測(cè)定和DNAladder結(jié)果顯示，3-MA處理后抑制膜電位下降作用減弱，DNA斷裂片段增加，以上結(jié)果表明:水蛭酶解物通過(guò)自噬過(guò)程抑制泡沫細(xì)胞的形成和抗oxLDL的氧化損傷作用。
　　ACAT1、ABCA1和LXRα的PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水蛭酶解物不能影響ABCA1和LXRα轉(zhuǎn)錄水平的變化。但能上調(diào)ACAT1的轉(zhuǎn)錄水平