小RNA深度測序在幾種木本植物病毒鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、植物病毒是一類極為重要的病原物，對生產(chǎn)實(shí)踐造成了很大的危害。林木在社會經(jīng)濟(jì)及生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，林木病毒有廣泛的地理分布和寄主范圍，對森林健康、生態(tài)環(huán)境有很大的潛在威脅。蘊(yùn)藏在自然界木本植物中的病毒是個極大的未知數(shù);同時，木本植物上的病毒往往很難通過摩擦接種的方式進(jìn)行人工接種，利用傳統(tǒng)方法檢測木本植物病毒非常困難。小RNA深度測序技術(shù)突破了傳統(tǒng)病毒檢測方法的局限性，開辟了大規(guī)模、快速診斷植物病毒的領(lǐng)域。利用這種技術(shù)能同時檢測

2、植物樣品中已知的和未知的、含量高的及含量低的所有的RNA病毒、DNA病毒以及類病毒。本文探討了小RNA深度測序及其組裝技術(shù)在檢測木本植物病毒中的應(yīng)用，以期全面地了解木本植物病毒的種類多樣性。我們的研究為發(fā)掘新的植物病毒資源以及預(yù)防林業(yè)生產(chǎn)上的病毒病害提供了指導(dǎo)。
　　利用高通量測序技術(shù)對采自浙江杭州表現(xiàn)花葉癥狀的紫藤(Wisteria sinensis)、采自浙江臨安表現(xiàn)花葉癥狀的南天竹(Nandina domestica)和浙江

3、桐鄉(xiāng)表現(xiàn)花葉卷葉癥狀的桑樹(Morus alba L.)的病原進(jìn)行了分子鑒定。利用小RNA深度測序技術(shù)，通過contigs拼接和比對，3種植物上的病毒分別為紫藤花葉病毒(Wisteria veinmosaic virus，WVMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和?；ㄈ~卷葉病相關(guān)病毒(Mulberry mosaic leaf roll-associated virus，MMLRaV)，其中CMV侵染

4、我國南天竹為國內(nèi)的首次報道。
　　對采自浙江臨安表現(xiàn)花葉癥狀的美國山核桃(Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)樣品進(jìn)行了基于小RNA深度測序技術(shù)的高通量鑒定，該病毒為1種新的RNA病毒，暫命名為美國山核桃花葉相關(guān)病毒(Pecan mosaic-associated virus，PMaV)。 PMaV基因組全長9310 nt，序列中A、T、C、 G4種堿基的含量分別為35.35％、25.49％、1

5、8.49％和20.66％，5'非編碼區(qū)(5' UTR)包含57個核苷酸，3'非編碼區(qū)(3'UTR)包含175個核苷酸。PMaV的基因組結(jié)構(gòu)具有典型的馬鈴薯Y病毒屬成員的基因組結(jié)構(gòu)特征，包含一個9078nt的開放閱讀框(Open ReadingFrame，ORF)，經(jīng)推導(dǎo)其編碼一個由3026個氨基酸(amino acid，aa)聚合而成的多聚蛋白，推測PMaV編碼的多聚蛋白翻譯后會被切割成11個成熟的蛋白質(zhì):P1、HC-Pro、 P3、6

6、K1、 C1、6K2、 NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、 CP、 PIPO。它的多聚蛋白切割位點(diǎn)分別是LYWRGF/S(P1/HC-Pro)、KLYKVG/G(HC-Pro/P3)、DVITLQ/S(P3/6K1)、CMTFQ/S(6KI/C1)、DAIRFQ/S(C1/6K2)、DTITLQ/G(6K2/NIa-VPg)、 DEIQFE/A(NIa-Vpg/NIa-Pro)、 DSMKFQ/G(NIa-Pro/NIb)和AGA

7、SAQ/S(NIb/CP)。用PMaV基因組全序列與36種其他馬鈴薯Y病毒科成員的全序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。PMaV全序列與萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus，LMV)的相似度最高，為58.9％，并與LMV的進(jìn)化關(guān)系最為緊密，形成一個小進(jìn)化簇。PMaV多聚蛋白氨基酸全長序列與PVY屬其它病毒的同源性在52％-53％之間。PMaV的CP蛋白序列在核苷酸水平上與LMV的同源性最高，為73％;在CP氨基酸水平上

8、的同源性與蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)最高，為68％。多聚蛋白氨基酸全長序列以及系統(tǒng)進(jìn)化樹均顯示PMaV與LMV的進(jìn)化關(guān)系最為緊密。由此可見，無論是按照Adams等人的標(biāo)準(zhǔn):核苷酸一致性小于76％，且氨基酸一致性小于82％;還是按照ICTV第八次報告中確定的標(biāo)準(zhǔn):核苷酸一致性小于85％，或CP氨基酸序列一致性小于80％，PMaV顯然符合Potyvirus屬不同種的定種標(biāo)準(zhǔn)。通過病毒汁液摩擦接種的方法，

9、PMaV無法侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)和普通煙(N.tabacum)兩種供試植物。感病美國山核桃的葉片經(jīng)負(fù)染后，在透射電鏡下看到許多線狀的病毒粒子，呈柔軟彎曲或較直的線狀，長約750 nm，符合PVY屬病毒粒子的特征。
　　對采自云南德宏州的檸檬（Citrus limon）病葉樣品進(jìn)行了基于深度測序技術(shù)的分子鑒定。結(jié)果表明，該檸檬受到了啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid, HSVd)的

10、侵染。HSVd全長序列與HSVd CC-D isolate1(GenBank登錄號:FJ716188.1)的同源性為100％。在C.limon中，HSVd來源的小RNA（siRNAs）長度以21 nt為主，來源于HSVd正義鏈和負(fù)義鏈的siRNAs數(shù)量幾乎相等。HSVd-siRNAs序列的5'起始核苷酸堿基偏好于鳥嘌呤(Guanine，G)。此外，熱點(diǎn)區(qū)分析顯示，大量的HSVd-siRNAs來源于HSVd基因組的C區(qū)和V區(qū)。植物類病毒的

11、侵染和產(chǎn)生癥狀與類病毒來源的小RNA有關(guān)，位于HSVd多變區(qū)（V區(qū)）的5-6個核苷酸堿基構(gòu)成的木質(zhì)陷孔病表達(dá)序列“cachexia expression motif”決定了寄主癥狀的發(fā)生。利用生物信息學(xué)手段，我們從HSVd來源的小RNA中，提取到了67條5'端前10個堿基包含“cachexia expression motif”序列的HSVd-siRNA，然后通過預(yù)測軟件psRNA Target對HSVd-siRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測，對

12、其中五個數(shù)值最高的靶基因與癥狀發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了分析。同時，用miRNA靶基因預(yù)測軟件RNA22驗(yàn)證了這五個靶基因是由HSVd-siRNAs所調(diào)控的。我們的研究結(jié)果表明，HSVd-siRNAs可能參與了寄主的基因表達(dá)，并影響寄主病害癥狀的產(chǎn)生。
　　通過高通量小RNA測序?qū)Σ勺哉憬R安的表現(xiàn)花葉癥狀的大青樣品進(jìn)行了病毒鑒定，該病毒為中國大青金色花葉病毒(Clerodendrum golden mosaic chinavirus，Cl

13、GMCNV)。ClGMCNV的DNA-A組份全序列長2776 bp，與Clerodendrumgolden mosaic China virus complete DNA-A genome, isolate YX1(GenBank登錄號:FN396962.1)相似性為99％; DNA-B組份全序列長2729 bp，與Clerodendrum goldenmosaic China virus complete DNA-B genome,

14、isolate YX1(GenBank登錄號:FN396963.1)同源性98％。采用了Velvet和Velvet-Oases兩種方法，并設(shè)定了不同的參數(shù)(k-mer分別為15、17、19、21)，對大青樣品的深度測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，在對序列進(jìn)行拼接比對時，不同的拼接軟件和不同的參數(shù)設(shè)置對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有很大的影響。利用Velvet軟件，K-mer為15時，拼接得到的contigs數(shù)量及長度最大，可以覆蓋ClGMCNV基因組全長7

15、0％以上，而K-mer為21時，拼接得到的contigs僅僅能覆蓋ClGMCNV基因組全長30％左右。利用Velvet-Oases分析方法，我們將不同K-mer值組裝的contigs又進(jìn)行了拼接組裝，發(fā)現(xiàn)最終得到的contigs覆蓋到基因組的比例顯著提高，最高達(dá)到88.25％。我們的研究提供了一套利用small RNA深度測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定病毒以及組裝得到病毒基因組的流程。為了更加清楚地看到深度測序所得到的病毒來源小RNA在