小RNA深度測(cè)序在柑橘新發(fā)病毒的鑒定及TuMV誘導(dǎo)的抗病毒新機(jī)制中的研究.pdf

1、我國(guó)果樹資源豐富，各類水果總產(chǎn)量位居世界首位，因此其經(jīng)濟(jì)重要性不言而喻。病毒病害可影響果樹植株的正常生長(zhǎng)，甚至給相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。果樹病毒病害種類較多，其中部分病害的病原至今未能確認(rèn)，因此果樹病毒病害的檢測(cè)與鑒定對(duì)于生產(chǎn)及防治至關(guān)重要。果樹病毒往往缺乏相應(yīng)的草本寄主，在木本植物內(nèi)的復(fù)制積累量低，分布不均且具有季節(jié)性差異，存在潛伏侵染的現(xiàn)象，且果樹組織中多富含多糖多酚等復(fù)雜成分，這些因素限制了傳統(tǒng)病毒檢測(cè)方法在果樹病毒上的鑒定工作。高

2、通量測(cè)序技術(shù)（如小RNA深度測(cè)序技術(shù)）的發(fā)展大大加快了果樹病毒檢測(cè)和鑒定的效率，用于可鑒定包括柑橘在內(nèi)的果樹未知病毒，挖掘更多病毒種類。小RNA（small RNA，sRNA）深度測(cè)序技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確及高通量等優(yōu)點(diǎn)，為植物病毒快速檢測(cè)鑒定的新方法。
　　本研究利用sRNA深度測(cè)序技術(shù)，鑒定兩種不同種類的柑橘病毒，并以此探討該技術(shù)在果樹病毒鑒定中的應(yīng)用。通過sRNA深度測(cè)序技術(shù)，從采自重慶地區(qū)的表現(xiàn)黃化脈明癥狀的檸檬樣品中鑒定到柑

3、橘黃化脈明病毒（Citrusyellow vein clearing virus，CYVCV）。通過序列拼接最終獲得了該病毒全長(zhǎng)基因組序列，研究發(fā)現(xiàn)其分離物CQ與CYVCV土耳其分離物Y1、云南分離物YN及巴基斯坦分離物PK的序列一致性分別為97.3%、98.8%及97.6%，同時(shí)對(duì)病毒編碼的開放閱讀框（Open reading frame, ORF）也進(jìn)行了分析。聚類分析表明，分離物CQ屬于甲型線性病毒科（Alphaflexiviri

4、dae）柑橘病毒屬（Mandarivirus）。除此之外，本文首次分析了 CYVCV侵染檸檬后的病毒小 RNA（virus-derived small interfering RNAs，vsiRNAs）表達(dá)譜特征，CYVCV vsiRNAs以21-及22-nts兩種為主，它們?cè)贑YVCV基因組上連續(xù)且不均勻分布，源于病毒負(fù)鏈的vsiRNAs豐度比正鏈高。本研究對(duì)CYVCV vsiRNAs5’-端堿基偏好性也做了分析，結(jié)果暗示了這些vsi

5、RNAs可能與柑橘體內(nèi)不同的Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合進(jìn)而行使各種生物學(xué)功能。該樣品為CYVCV單獨(dú)侵染。柑橘褪綠矮縮病（Citrus chlorotic dwarf disease，CCDD）也是柑橘上發(fā)現(xiàn)的一種病毒病害，最早發(fā)現(xiàn)于土耳其。本章繼續(xù)利用 sRNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)采自中國(guó)云南地區(qū)的表現(xiàn)褪綠畸形癥狀的檸檬樣品進(jìn)行病原鑒定。對(duì) sRNA表達(dá)譜分析后發(fā)現(xiàn)，類似于CYVCV，源自于病毒的contigs幾乎覆蓋了分離物CC

6、DaV-TK4（Citrus chlorotic dwarf-associated virus, CCDaV，GenBank No. JQ920490）的全基因組。通過引物設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)成功獲得該病毒基因組全長(zhǎng)信息，全長(zhǎng)為3642-nts。序列分析發(fā)現(xiàn)其與分離物CCDaV-TK4的基因組核苷酸序列一致性高達(dá)99.3%，其基因組與其它雙生病毒結(jié)構(gòu)類似，如單鏈環(huán)狀DNA、莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部的九核苷酸序列等。聚類分析表明該分離物CCDaV-CN00

7、1屬于雙生病毒科（Geminivididae）。本研究同樣分析了CCDaV vsiRNAs的表達(dá)譜，vsiRNAs以22-、21-及24-nts為主，病毒正義鏈vsiRNAs的豐度要高于反義鏈。結(jié)合vsiRNAs表達(dá)譜，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了該病毒基因組反義鏈存在一個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。分離物CCDaV CN001是CCDaV的第二條全長(zhǎng)基因組序列，其發(fā)現(xiàn)豐富了CCDaV的序列信息。通過上述兩種不同種類柑橘病毒的鑒定，表明了 sRNA深度測(cè)序技術(shù)在果樹病