柑橘類病毒的鑒定及其小RNA的深度測序分析研究.pdf

1、類病毒是一類246～401-nt大小的，閉合環(huán)狀的，單鏈小分子RNA。類病毒能在寄主植物體內(nèi)復(fù)制，是一種重要的植物病原。柑橘是七種柑橘類病毒的自然寄主。它們分屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Pospiviroidae）的四個屬。其中柑橘裂皮類病毒（Citrusexocortisviroid，CEVd）屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬
　　 （Pospiviroid）;啤酒矮化類病毒(Hopstuntviroid，HSVd)屬于啤酒花矮化類

2、病毒屬（Hostuviroid）;柑橘樹皮裂紋類病毒（Citrusbarkcrackingviroid，CBCVd）屬于椰子死亡類病毒屬（Cocadviroid）;柑橘曲葉類病毒[Citrusbentleafviroid，CBLVd（包括CBLVd的特定株系，CVd-Ⅰ-LSS）]，柑橘矮化類病毒（Citrusdwarfingviroid，CDVd），柑橘類病毒Ⅴ(CitrusviroidⅤ,CVd-Ⅴ)和柑橘類病毒Ⅵ（Citrusvi

3、roidⅥ，CVd-Ⅵ）屬于蘋果銹果類病毒屬（Apscaviroid）。CEVd和HSVd的特定株系分別是柑橘裂皮病和柑橘木質(zhì)陷孔病的病原，對柑橘生產(chǎn)造成嚴重危害。
　　 (1)柑橘是中國南方15個省份（自治區(qū)、直轄市）最重要的經(jīng)濟作物之一，栽培面積廣闊。枳和枳橙是各產(chǎn)區(qū)多數(shù)柑橘品種使用的砧木。然而枳和枳橙對柑橘類病毒十分敏感，容易造成嚴重的類病毒病害。本研究從重慶、四川、浙江、江西、湖南和云南等6個柑橘主產(chǎn)區(qū)采集了42份柑桔類

4、病毒毒源樣品。重點從砧木樹皮縱向開裂、樹皮變色充膠及植株矮化的柑桔樹上采樣。將毒源材料嫁接到‘Etrog’香櫞‘861-S-1’選系上，12個月后，42份樣品中，39份樣品嫁接的指示植物表現(xiàn)出典型的類病毒癥狀，如卷葉和矮化。
　　 本研究提取香櫞葉片的總RNA后，通過一步法多重RT-PCR同時檢測CEVd，CBLVd，HSVd和CDVd四種類病毒，使用一步法RT-PCR單獨檢測CBCVd，CVd-Ⅴ，CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LS

5、S。檢測結(jié)果表明，CEVd，CBLVd，HSVd，CDVd，CBCVd，CVd-Ⅴ，CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS分別在13、14、37、35、2、3、8和2個樣品中檢測呈陽性，陽性率分別為31.0％，33.3％，88.1％，83.3％，4.8％，7.1％，19.0％和4.8％。42份樣品中，有36份樣品被多種類病毒復(fù)合侵染。通過生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，即使沒有CEVd的侵染，其他幾種類病毒復(fù)合侵染香櫞時，也能引起與CEVd相類似的癥狀。通過田

6、間癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，即使沒有CEVd，其它種類的柑橘類病毒復(fù)合侵染也能在枳砧木上引起典型的裂皮病癥狀。這暗示了，在中國的柑橘產(chǎn)區(qū)，部分與裂皮病相類似的病害是由非CEVd的多種柑橘類病毒復(fù)合侵染造成的。
　　 通過對每種類病毒代表分離物全長序列克隆測序發(fā)現(xiàn)，CEVd在眉山9號樣品的分離物是強毒株系CEVd-E117。三個CBLVd分離物中，有一個是CVd-Ⅰb株系，另外兩個是CVd-Ⅰa株系。HSVd只分離到了CVd-Ⅱa株系，沒有發(fā)

7、現(xiàn)木質(zhì)陷孔病的病原CVd-Ⅱb或者CVd-Ⅱc株系。三個CDVd分離物中，有一個是CVd-Ⅲb，另外兩個被CVd-Ⅲa和CVd-Ⅲb混合感染，沒有發(fā)現(xiàn)CVd-Ⅲc株系。
　　 將在中國分離到的CBCVd，CVd-Ⅴ，CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS序列與目前已報道的相應(yīng)序列一起構(gòu)建進化樹。結(jié)果表明:(a)所有的CBCVd和CVd-Ⅰ-LSS序列，根據(jù)一定序列差異分別歸于兩個主要的群體;(b)所有的CVd-V序列根據(jù)一定的地理分布歸

8、于兩個主要的群體;(c)所有的CVd-Ⅵ序列根據(jù)一定的寄主差異歸于三個主要的群體。本研究是CBCVd，CVd-Ⅴ，CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS在中國的首次報道。
　　 (2)巴基斯坦是世界十大柑橘產(chǎn)區(qū)之一，特別以‘Kinnow’寬皮柑橘的生產(chǎn)聞名于世。巴基斯坦柑橘的產(chǎn)量有96％集中于Punjab省。本研究從巴基斯坦Punjab省的三個柑橘主產(chǎn)區(qū)Sargodha，Bhalwal和Faisalabad的果園采集了34份柑桔類病毒毒

9、源樣品。使用一步法多重RT-PCR同時檢測CEVd，CBLVd，HSVd，CDVd和CBCVd五種類病毒。CEVd，CBLVd，HSVd和CDVd分別在12、8、31和17個樣品中檢測為陽性，陽性率分別為35.3％，23.5％，91.2％和50.0％，未檢測到CBCVd。34份樣品中有23份被多種類病毒復(fù)合侵染。
　　 對每種類病毒代表分離物全長序列克隆測序表明，所有的CBLVd序列都屬于CVd-Ⅰa株系。大部分HSVd克隆是C

10、Vd-Ⅱa株系，其中一個克隆是具有木質(zhì)陷孔病決定因子的CVd-Ⅱb，沒有發(fā)現(xiàn)CVd-Ⅱc株系。大部分CDVd克隆是CVd-Ⅲb株系，沒有發(fā)現(xiàn)CVd-Ⅲa和CVd-Ⅲc株系，同時發(fā)現(xiàn)了不同于這三個株系的CDVd新群體。這是CEVd，CBLVd，HSVd和CDVd在巴基斯坦的首次分子報道，同時也是首次在該地區(qū)分離到木質(zhì)陷孔病的病原。
　　 (3)CVd-V是最近才鑒定到的一種新的柑橘類病毒，正式歸類于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Posp

11、iviroidae），蘋果銹果類病毒屬(Apscaviroid)。本研究從巴基斯坦Punjab省檢測到334份CVd-Ⅴ陽性柑橘樣品，陽性率高達93％，這是CVd-Ⅴ在該國的首次報道。對7種代表性品種樣品進行生物學(xué)鑒定和所有種類柑橘類病毒的RT-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)這7個樣品被多種類病毒復(fù)合侵染，其中CVd-Ⅰ-LSS是在巴基斯坦的首次報道，沒有檢測到CBCVd和CVd-Ⅵ。從來自不同產(chǎn)區(qū)的11份CVd-Ⅴ分離物中獲得了68個獨立的cDNA

12、克隆，序列大小為292～295-nt。序列多樣性分析發(fā)現(xiàn)，來自巴基斯坦的CVd-Ⅴ種群序列多樣性與世界上其他地區(qū)報道的CVd-V種群序列多樣性相一致。通過遺傳多樣性和進化樹分析，目前世界上所報道的CVd-Ⅴ被分為兩個主要組群，推測巴基斯坦很可能是CVd-Ⅴ的主要發(fā)源地之一。本研究證實了，CVd-Ⅴ不是最近才發(fā)生的一種類病毒，分布范圍比預(yù)期要廣。本研究豐富了CVd-Ⅴ的發(fā)生、分布和進化起源。
　　 (4)柑橘是七種柑橘類病毒的自然

13、寄主。對柑橘類病毒致病機理方面的研究相對較少。最近的研究表明，來源于類病毒的小RNA在類病毒致病性方面起到了至關(guān)重要的作用。因此柑橘類病毒小RNA的鑒定，對理解柑橘類病毒與柑橘寄主的互作機理方面具有重要價值。本研究通過Solexa-Illumina平臺對3份感染類病毒和1份健康的香櫞葉片樣品，進行了小RNA的深度測序。每份樣品都被4到6種柑橘類病毒復(fù)合侵染，并在香櫞上表現(xiàn)出典型的類病毒癥狀。分析表明:(a)每份樣品中所有類病毒的小RNA

14、總讀數(shù)占樣品小RNA總讀數(shù)的7％左右;(b)不同類病毒，其產(chǎn)生的小RNA來自正負鏈的比例不同，以21-nt和22-nt大小為主;(c)類病毒小RNA覆蓋了類病毒的正負鏈全基因組，主要集中出現(xiàn)在正負基因組的某些特定的區(qū)域。其中CEVd，CBCVd，CVd-Ⅴ，CVd-Ⅵ和CVd-Ⅰ-LSS負鏈產(chǎn)生的小RNA主要集中在TR區(qū)域的下方。CBLVd，HSVd和CDVd在不同的類病毒組合中具有相似的熱點區(qū)域。(d)在兩份類病毒感染樣品中，內(nèi)源的2

15、4-nt小RNA所占比例大幅度下降，而內(nèi)源的21-nt小RNA所占比例大幅度上升。進一步分析發(fā)現(xiàn)，類病毒復(fù)合侵染可能誘導(dǎo)了植物內(nèi)源21-ntmiRNAs的積累和24-ntrasiRNAs的降低。本研究為柑橘類病毒致病機理，特別是復(fù)合侵染致病機理的解釋提供了新思路。
　　 (5)驗證了通過小RNA的深度測序預(yù)測未知類病毒。發(fā)現(xiàn)了“程序性過濾重疊小分子RNA”(PFOR)程序用于預(yù)測類病毒存在特異性和靈敏度上的缺陷，并提出了若干改進