東亞飛蝗Lm-ATP5A功能分析及其在提高綠僵菌毒力中的作用研究.pdf

1、東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis)是我國重要的遷飛性害蟲。長期以來，對其防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥。然而，長時間、單一、過分依賴化學(xué)農(nóng)藥，已導(dǎo)致“3R”問題。綠僵菌已被開發(fā)成多種制劑應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的防治，但其致死時間長，嚴(yán)重制約其推廣應(yīng)用。篩選新的殺蟲靶標(biāo)，研制安全、高效的殺蟲劑是提高殺蟲劑質(zhì)量的核心路徑。ATP合成酶是生物體的能量工廠，它利用質(zhì)子梯度生成ATP，從而提供細(xì)胞和生物體所需90％的能量?；谠?/p>

2、酶對生物體的重要性，有可能成為潛在的殺蟲靶標(biāo)。本研究的目標(biāo)，一是以RNA干擾為技術(shù)手段，篩選新的安全、高效的殺蟲靶標(biāo)；二是嘗試?yán)美ハx病原真菌表達(dá)害蟲靶標(biāo)雙鏈RNA，通過干擾寄主昆蟲必需基因的方式提供真菌的殺蟲毒力，探索提高真菌殺蟲毒力的新方法。
　　東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基的基因克隆及其功能研究通過序列比對及3`-RACE，從東亞飛蝗中克隆到東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基(Lm-ATP5A)的cDNA序列。序列全長18

3、88bp，其開放閱讀框長1656bp，編碼551個氨基酸。設(shè)計了Lm-ATP5A的210bp特異片段，體外合成dsRNA，每頭蟲注射100ng dsATP5A，成功降低了靶標(biāo)基因的表達(dá)，降低了酶活，使胞內(nèi)ATP含量降低；注射dsRNA還降低了血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量，使血細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少以及改變線粒體形態(tài)及膜電勢；東亞飛蝗若蟲和成蟲在注射dsRNA后都會死亡，注射dsRNA對五齡若蟲和成蟲的LT50分別為2.3天、4.2天。上述結(jié)果表明：

4、Lm-ATP5A是東亞飛蝗的必需基因，是防治東亞飛蝗的潛在靶標(biāo)。
　　表達(dá)dsATP5A綠僵菌工程菌株的構(gòu)建及其毒力測定以蝗綠僵菌CQMa102為受體菌，運用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將ATP5A-RNAi干擾載體導(dǎo)入受體菌，篩選獲得表達(dá)dsATP5A的轉(zhuǎn)化菌株。半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，dsATP5A在轉(zhuǎn)基因菌株中獲得成功轉(zhuǎn)錄。將野生菌株、工程菌株的孢子分別點滴侵染東亞飛蝗五齡若蟲，工程菌株的LT50比野生型減少10.9%

5、（p<0.05）；定量PCR和Western blot分析了東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因表達(dá)，結(jié)果顯示：與野生型蝗綠僵菌相比，工程菌株侵染后東亞飛蝗體內(nèi)Lm-ATP5A轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)量均明顯降低；工程菌株侵染5天后，昆蟲血腔中蟲菌體含量為野生型的15.8倍。以上結(jié)果表明:利用昆蟲病原真菌“蝗綠僵菌”能夠表達(dá)東亞飛蝗的dsATP5A，表達(dá)dsATP5A的工程菌株能夠干擾東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且能夠加速在昆蟲血