蝗綠僵菌Macwh基因功能研究.pdf

1、真菌細(xì)胞壁涉及細(xì)胞附著，形態(tài)建成等多種生理功能。細(xì)胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病過程中發(fā)揮著非常重要的作用。熒光增白劑高度敏感蛋白cwh具有維持細(xì)胞壁完整性的功能，這一現(xiàn)象僅在釀酒酵母中有報(bào)道，在致病真菌中尚無該類基因的研究和報(bào)道。昆蟲病原真菌具有獨(dú)特的體壁侵染方式，細(xì)胞壁在病原性真菌的抗逆及侵染致病過程中發(fā)揮著十分重要的作用。本研究以蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）為實(shí)驗(yàn)材料，通過同源重組的方法構(gòu)建該基因的敲除及回

2、復(fù)菌株對(duì)該基因進(jìn)行功能研究。獲得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.Macwh1和Macwh2生物信息學(xué)分析
　　根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到Macwh1和Macwh2基因，生物信息學(xué)分析表明Macwh1與Macwh2編碼的氨基酸序列無同源性。其中Macwh1登錄號(hào)為XP_007815818，編碼957個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為7.02，蛋白質(zhì)分子量為107.02KDa，基因組含7個(gè)內(nèi)含子。Macwh2登錄號(hào)為XP_0078089

3、21，編碼的氨基酸133個(gè)，等電點(diǎn)為9.48，蛋白質(zhì)分子量為13.85KDa，基因組含2個(gè)內(nèi)含子。
　　2.Macwh單敲除及回復(fù)菌株、Macwh1-Macwh2雙敲除菌株的獲得
　　為了研究蝗綠僵菌Macwh1和Macwh2的功能，利用同源重組的方法構(gòu)建了各基因的敲除載體，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了回復(fù)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌，經(jīng)抗性篩選PCR驗(yàn)證篩選及Southen雜交驗(yàn)證，得到正確的敲除菌株和回復(fù)菌株。
　　3.

4、Macwh的缺失導(dǎo)致蝗綠僵菌毒力降低
　　以東亞飛蝗五齡蟲為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行體表點(diǎn)滴和體內(nèi)注射接種實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：體表點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)中敲除菌株的毒力都顯著低于野生型回復(fù)菌株，并且蝗蟲血液中蟲菌體數(shù)量顯著減少；而注射實(shí)驗(yàn)表明，各敲除菌株與野生型和回復(fù)菌株相比，毒力并無顯著差異。對(duì)毒力機(jī)制研究的結(jié)果表明Macwh的缺失不影響蝗綠僵菌孢子在蝗蟲后翅上萌發(fā)，而影響附著胞的形成率及其膨壓。Macwh通過調(diào)控與體壁穿透相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)而影響

5、毒力。
　　5.Macwh影響細(xì)胞壁的完整性及抗逆性
　　對(duì)細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，各敲除菌株中幾丁質(zhì)、甘露糖蛋白含量的顯著低于野生型，而β-1,3-葡聚糖含量與野生型相比無顯著差異；透射電鏡表明，各敲除菌株細(xì)胞壁變薄。RT-PCR檢測(cè)表明，與孢子細(xì)胞壁完整性相關(guān)基因中幾丁質(zhì)合成酶基因的表達(dá)顯著下調(diào)，孢子疏水性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，各敲除菌株孢子的疏水性降低，孢子表面疏水蛋白基因的表達(dá)量也顯著下調(diào)。在加入了細(xì)胞壁破壞劑（CFW）的

6、1/4SDA培養(yǎng)基上，敲除菌株的菌落顯著小于野生型，表明對(duì)細(xì)胞壁破壞劑敏感；紫外照射處理后，敲除菌株與野生型相比孢子萌發(fā)率顯著降低，通過qRT-PCR對(duì)紫外相關(guān)基因如phr1，uve-1等基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各敲除菌株中phr1，uve-1的表達(dá)量均顯著下調(diào)。結(jié)果表明Macwh影響了細(xì)胞壁的完整性，Macwh通過影響與抗紫外相關(guān)基因的表達(dá)量，進(jìn)而影響對(duì)紫外的耐受性。
　　綜上所述，Macwh在蝗綠僵菌侵染致病過程的侵染階段