金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達(dá)基因篩選與體內(nèi)定殖階段cDNA文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、重慶大學(xué)博士學(xué)位論文金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達(dá)基因篩選與體內(nèi)定殖階段cDNA文庫(kù)構(gòu)建姓名：張傳博申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程指導(dǎo)教師：夏玉先20090612重慶大學(xué)博士學(xué)位論文菌體( h y p h a l b o d y ) 。2 ．根據(jù)寄主血細(xì)胞和病原真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)差別，建立和完善了利用蛋白酶K 和S D S 迅速裂解寄主血細(xì)胞的方法，整個(gè)流程時(shí)間約4 0 m i n ，R T - P C R 檢測(cè)表明，利用寄主血細(xì)胞裂

2、解釋放的內(nèi)源性R N a s e s 和后續(xù)P B S 洗滌可高效去除血淋巴分離綠僵菌菌體中的寄主核酸污染，這一結(jié)論也被后續(xù)E S T 序列分析所證明。3 ．以寄主體內(nèi)分離，去除寄主核酸污染的綠僵菌菌體提取m R N A 為實(shí)驗(yàn)組( t e s t e r ) ，用R N A f r a g m e n t a t i o n b u f f e r 處理東亞飛蝗翅膀，降解寄主核酸，并誘導(dǎo)附著孢形成與分化，以該時(shí)期的菌體提取m R N

3、A 為驅(qū)動(dòng)組( d r i v e r ) ，進(jìn)行抑制消減雜交( s u p p r e s s i o n s u b t r a e t i v eh y b r i d i z a t i o n , S S H ) ，篩選出3 5 0 個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序，獲得的E S T 序列經(jīng)聚類分析、共拼接成1 2 0 u n i q u e E S T s ，其中1 0 0 條s i n g l e t o n s ，2 0 條e o n

4、t i g s ，經(jīng)基因注釋和功能分類，2 9 條( 2 4 ．1 7 ％) E S T s 和N R 數(shù)據(jù)庫(kù)有同源性，其功能參與各種細(xì)胞代謝和應(yīng)答過(guò)程，包括細(xì)胞代謝、蛋白代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能以及參與脅迫和抵抗等生物學(xué)過(guò)程。4 ．為驗(yàn)證消減效率，隨機(jī)選擇5 個(gè)預(yù)測(cè)基因，以半定量R T - P C R 分析了在綠僵菌侵染東亞飛蝗不同階段的表達(dá)水平，包括碗豆素脫甲基酶( p i s a t i n d e m e t h y l a s e

5、 )基因( M p d l ) ，?！┐蓟? 儀．e n o l a s e ) 基因( M e l ) ，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶( p r e n y lt r a n s f e r a s e ) 基因( M p t ) ，a ．1 ，2 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶( a ．1 ，2 ．m a n n o s y l t r a n s f e r a s e ) 基因( M m n t l ) ，膽堿脫氫酶( c h o l i nd e h

6、 y d r o g e n a s e ) 基因( M c d ) 。結(jié)果表明5 個(gè)基因均在定殖寄主血淋巴階段有較高的表達(dá)量。5 ．為篩選附著孢形成階段特異表達(dá)或上調(diào)表達(dá)基因，以無(wú)寄主核酸污染的蝗蟲翅膀誘導(dǎo)附著孢形成，提取m R N A 為實(shí)驗(yàn)組( t e s t e r ) ，以去除寄主核酸污染的血淋巴分離綠僵菌菌體提取m R N A 為驅(qū)動(dòng)組( d r i v e r ) ，消減雜交篩選出4 6 0 個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序，獲得3 2

7、9 條高質(zhì)量E S T s ，聚類分析、拼接成7 8 u n i q u eE S T s 。其中4 6 條E S T s 與數(shù)據(jù)庫(kù)中己知蛋白序列有明顯的同源性，2 4 條己知功能的同源E S T s涉及多種代謝和應(yīng)答過(guò)程，包括細(xì)胞代謝、蛋白代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能以及脅迫和抵抗等生物學(xué)過(guò)程。6 ．隨機(jī)選擇1 2 條E S T s ，分別提取綠僵菌在蝗蟲翅膀生長(zhǎng)8h 、1 5h 、2 4 h 、3 0 h ，以及體內(nèi)定殖階段( 第2 天、第

8、3 天、第4 天、第5 天、第6 天、第7 天)血淋巴的總R N A ，D N a s e I 處理后，以3 ．磷酸甘油醛脫氫酶基因( G 3 p d h ) 為參照基因，進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明1 2 條E S T s 均在附著孢形成時(shí)期上調(diào)表達(dá)。7 ．D S N 均一化和S M A R T 技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了金龜子綠僵菌C Q M a l 0 2 定殖東亞飛蝗血淋巴階段的全長(zhǎng)均一化c D N A 文庫(kù)，并對(duì)整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行了E S T 序