侵染東亞飛蝗翅膀的金龜子綠僵菌在附著胞形成階段均一化cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與分析.pdf

1、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，在昆蟲(chóng)防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，真菌殺蟲(chóng)劑盡管安全，專一性好，無(wú)環(huán)境污染，但存在著殺蟲(chóng)速率慢的弱點(diǎn)，這在很大程度上阻礙了真菌殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用。金龜子綠僵菌侵染寄主昆蟲(chóng)時(shí)，孢子萌發(fā)后會(huì)形成附著胞——一種重要的侵染器官，能夠分泌多種蛋白酶降解昆蟲(chóng)體壁，并產(chǎn)生膨脹壓幫助侵染釘刺穿體壁。附著胞的形成及分化在金龜子綠僵菌侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)這一

2、階段病原真菌的致病機(jī)制進(jìn)行研究可為發(fā)展新型高效真菌殺蟲(chóng)劑提供依據(jù)。
　　國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)綠僵菌侵染昆蟲(chóng)體表階段的基因表達(dá)進(jìn)行了深入研究，采用的方法是往液體培養(yǎng)基中加入昆蟲(chóng)表皮提取物后培養(yǎng)綠僵菌，然后構(gòu)建綠僵菌的cDNA文庫(kù)進(jìn)行EST測(cè)序分析。綠僵菌在離體的液體培養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)處于腐生生活階段，而綠僵菌在侵染昆蟲(chóng)體表時(shí)處于寄生生活階段，在這兩種條件下生長(zhǎng)的綠僵菌的基因表達(dá)肯定會(huì)存在較大差別。本文以生長(zhǎng)于東亞飛蝗翅膀，且處于附著胞形

3、成分化階段的金龜子綠僵菌CQMa102為實(shí)驗(yàn)材料，成功構(gòu)建了綠僵菌的cDNA文庫(kù)，為深入揭示病原真菌的侵染機(jī)制提供有力的技術(shù)支撐。
　　為保證構(gòu)建的cDNA文庫(kù)不含寄主蝗蟲(chóng)的克隆，本研究中采用RNA fragmentation buffer降解東亞飛蝗翅膀所含的核酸，并且設(shè)計(jì)了蝗蟲(chóng)特異性引物，利用RT-PCR反應(yīng)建立監(jiān)控體系保證構(gòu)建文庫(kù)的cDNA不被蝗蟲(chóng)序列污染。觀察比較金龜子綠僵菌CQMa102在處理與未處理翅膀上的萌發(fā)分化過(guò)程

4、，發(fā)現(xiàn)降解蝗蟲(chóng)翅膀核酸的處理方法不會(huì)影響綠僵菌在翅膀上的生長(zhǎng)。測(cè)序分析構(gòu)建的cDNA文庫(kù)獲得了221條EST序列，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蝗蟲(chóng)的序列存在，并且發(fā)現(xiàn)了一些具有代表性的、與綠僵菌侵染相關(guān)的基因。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.使用試劑RNA fragmentation buffer處理東亞飛蝗翅膀后，分別提取翅膀的DNA和total RNA，發(fā)現(xiàn)DNA與total RNA都已明顯降解。
　　2.根據(jù)已報(bào)道的蝗蟲(chóng)組成型表達(dá)

5、及高表達(dá)基因設(shè)計(jì)了靈敏度較高的特異性引物，用于RT-PCR檢測(cè)構(gòu)建文庫(kù)的cDNA是否含有蝗蟲(chóng)序列，檢測(cè)結(jié)果表明cDNA不含蝗蟲(chóng)DNA或RNA；
　　3.采用數(shù)碼生物顯微鏡觀察了綠僵菌 CQMa102在東亞飛蝗翅膀上萌發(fā)分化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)8 h左右孢子開(kāi)始萌發(fā)，16 h附著胞開(kāi)始形成，20 h大部分孢子已經(jīng)萌發(fā)，30 h附著胞大量形成，并有極少量的穿透釘形成；比較了綠僵菌CQMa102在處理與未處理翅膀生長(zhǎng)行為，發(fā)現(xiàn)差異不顯著。

6、　　4.以構(gòu)建文庫(kù)的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了金龜子綠僵菌CQMa102侵染階段特異表達(dá)的基因Mad1，Mpl1和Pr1A，表明cDNA包含已報(bào)道的綠僵菌毒力基因，具有一定代表性。
　　5.采用DSN（duplex-specific nuclease）均一化技術(shù)與SMART建庫(kù)技術(shù)相結(jié)合的方法，成功構(gòu)建了生長(zhǎng)于蝗蟲(chóng)翅膀且處于附著胞形成分化時(shí)期的金龜子綠僵菌CQMa102 cDNA文庫(kù)。通過(guò)隨機(jī)測(cè)序文庫(kù)克隆，獲得了高質(zhì)量的

7、EST序列221條，共代表162條unigene，其比率為73.3％，表明文庫(kù)的均一化效果較好；將EST序列與蝗蟲(chóng)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)EST序列與蝗蟲(chóng)序列顯示高相似性，表明構(gòu)建的cDNA文庫(kù)只包含綠僵菌CQMa102的表達(dá)基因，而不含有宿主蝗蟲(chóng)的序列。
　　6.在GenBank上用BlastX對(duì)162條unigene進(jìn)行序列相似性比對(duì)。結(jié)果表明93條unigene的編碼產(chǎn)物與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能蛋白存在