大黃魚(Pseudosciaena crocea)IL-10和香魚(Plecoglossus altivelis)IL-17的基因克隆和表達(dá).pdf

1、為了解大黃魚（Pseudosciaena crocea）白細(xì)胞介素10（interleukin10，IL-10）和香魚（Plecoglossus altivelis）白細(xì)胞介素17（interleukin17，IL-17）的序列特征、系統(tǒng)發(fā)育和有關(guān)組織的表達(dá)差異，采用 RACE（rapid amplification of cDNA ends）-PCR法擴(kuò)增大黃魚 IL-10和香魚 IL-17 cDNA部分序列，并利用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建

2、IL-10和IL-17重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　獲得的IL-10 cDNA部分序列，長899bp，含完整開放閱讀框（555bp），編碼184個(gè)氨基酸，具有構(gòu)成兩對二硫鍵的四個(gè)保守半胱氨酸，N端22個(gè)氨基酸為信號肽序列，含有 IL-10家族特征序列。以15種脊椎動物的IL-10氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示大黃魚 IL-10和其他魚類聚為一大支，在進(jìn)化上與同屬鱸形目的鱸魚最近，其次是金頭鯛和綠河豚；同源序列比對結(jié)果顯示大黃魚 IL-10和

3、鱸魚相似度達(dá)78％，與金頭鯛和綠河豚分別是76%和63%，符合傳統(tǒng)分類學(xué)定義。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測結(jié)果顯示，健康大黃魚8個(gè)組織（心、肝、脾、腎、鰓、腦、肌和腸）中 IL-10均表達(dá)，其中以鰓和腸表達(dá)量最高；溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）侵染后，5個(gè)組織（腸、腦、脾、肝和腎）中 IL-10基因表達(dá)量均顯著高于對照組（P<0.05），其中腎中表

4、達(dá)量變化最大（注射8h時(shí)為對照組的10.06倍）、其次是肝組織（在注射8h后為對照組的8.79倍）。
　　獲得的IL-17 cDNA部分序列，長892bp，含完整開放閱讀框（534bp），編碼177個(gè)氨基酸，N端19個(gè)氨基酸為信號肽序列，在3’端非編碼區(qū)存在7個(gè)mRNA不穩(wěn)定信號 ATTTA，成熟蛋白中含8個(gè)半胱氨酸殘基。構(gòu)建的NJ法系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，不同物種的相同 IL-17同源基因聚集在同一個(gè)分支上，香魚 IL-17則與其他脊椎

5、動物 IL-17C基因聚為一簇。同源比對結(jié)果顯示香魚 IL-17與虹鱒魚的IL-17C1和IL-17C2親緣關(guān)系最近，分別為40.72%和34.04%。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）檢測結(jié)果顯示，健康香魚8個(gè)組織（心、肝、脾、腎、鰓、腦、肌和腸）中 IL-17均有表達(dá)，以鰓和腎中表達(dá)量最高；鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）侵染后，肝臟中表達(dá)變化最大

6、（注菌8h時(shí)，IL-17的表達(dá)量是對照組的9.17倍），其次是脾（在注射4h時(shí)IL-17表達(dá)量是對照組的6.69倍）。
　　重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳后顯示重組融合蛋白均表達(dá)。Western blot檢測制備的鼠多克隆抗大黃魚 IL-10抗體和鼠多克隆抗香魚 IL-17抗體均能有效地與各自的重組蛋白結(jié)合，具有較好特異性。
　　上述結(jié)果為進(jìn)一步研究大黃魚 IL-10和香魚 IL-17的免疫功能與機(jī)制